抑制端粒酶活性對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及凋亡影響作用機(jī)制的研究.pdf

1、觀察端粒酶特異性抑制劑疊氮胸苷(3’-azido-23’-dideoxythymidine，AZT)對(duì)人TJ905 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(TJ905細(xì)胞)端粒酶活性的抑制作用，以及抑制端粒酶活性后對(duì)TJ905細(xì)胞增殖和凋亡的影響。檢測(cè)抑制端粒酶活性能否上調(diào)TJ905細(xì)胞抑癌基因生長(zhǎng)抑制因子1 (Ihibitor ofgrowth 1，ING1)的表達(dá)，分析TJ905細(xì)胞的ING1基因表達(dá)變化與其增殖活性和凋亡程度的相互關(guān)系。旨在探討抑制端

2、粒酶活性后對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的下游作用機(jī)制；了解ING1 基因編碼產(chǎn)物p33<'INGIb>在該機(jī)制中的作用和作用地位；評(píng)價(jià)AZT治療惡性膠質(zhì)瘤的效果和應(yīng)用前景。最終目的是進(jìn)一步加深對(duì)惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為以端粒酶為靶點(diǎn)進(jìn)行惡性膠質(zhì)瘤化學(xué)藥物靶向治療的可行性提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:將TJ905 細(xì)胞按1～5×10<'5>/ml接種于75cm<'2>培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組、AZT

3、 50μM組、AZT 100μM組、AZT 200μM組。常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第一、三、六代進(jìn)行以下檢測(cè)：以端粒重復(fù)擴(kuò)增法(telomericrepeatamplification proteocol，TRAP)檢測(cè)經(jīng)不同濃度AZT作用后TJ905細(xì)胞端粒酶活性的變化；以細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)AZT對(duì)TJ905細(xì)胞增殖活性及生長(zhǎng)速度的影響；通過：Ki-67和GFAP表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，觀察AZT抑制TJ905細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其衰老凋亡的作用

4、；以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、單細(xì)胞凝膠電泳分析法(single cell gel electrop horesis assay，SCGE)和TUNEL 法，檢測(cè)不同濃度AZT 對(duì)TJ905 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcriptPCR，RT-PCR) 方法檢測(cè)用不同濃度AZT作用后，TJ905 細(xì)胞p33<'INGlb> mRNA的表達(dá)變化。 結(jié)果：端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，各用藥組端粒酶

5、活性均明顯低于對(duì)照組，AZT200μM 組端粒酶活性下降最明顯。說明 AZT 能有效的抑制 TJ905細(xì)胞的端粒酶活性，其抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，三個(gè)用藥組TJ905細(xì)胞的克隆形成率均低于對(duì)照組(P<0.01)，AZT200μM組的克隆形成率低于AZT 50μM 組及AZT 100μM 組(P<0.01)，差異均有顯著性。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，各用藥組第六代TJ905細(xì)胞的Ki-67陽性細(xì)胞標(biāo)記指

6、數(shù)均明顯低于第一代(P<0.01)，而各用藥組第六代TJ905細(xì)胞的GFAP陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)均明顯高于第一代(P<0.01)，差異均有顯著性。以上結(jié)果說明AZT可通過抑制TJ905細(xì)胞的端粒酶活性，有效的抑制其增殖活性和誘導(dǎo)其成熟分化。 單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，各用藥組TJ905細(xì)胞在第一代時(shí)彗星拖尾細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)的數(shù)量即有增加，凋亡指數(shù)(AI％)高于對(duì)照組，有顯著性差異(P<0.01)；在第六代時(shí)DNA切割進(jìn)一步加重，凋

7、亡細(xì)胞彗星拖尾的尾矩明顯延長(zhǎng)。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，各用藥組TJ905細(xì)胞在第一代時(shí)凋亡指數(shù)與對(duì)照組相比即增加，并有顯著性差異(P<0.01)；傳代培養(yǎng)至第六代時(shí)，各用藥組的凋亡指數(shù)均較第一代升高，且第六代的AZT 200μM組及AZT 100μM組的凋亡指數(shù)均高于AZT 50μM 組，差異有顯著性(P<0.01)，與單細(xì)胞凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相同。流式細(xì)胞分析顯示，各用藥組的TJ905細(xì)胞在第一代即可出現(xiàn)凋亡峰，但凋亡率比較低；傳代

8、培養(yǎng)至第六代時(shí)再次出現(xiàn)明顯的凋亡峰，凋亡率達(dá)29％。以上結(jié)果說明AZT可通過抑制TJ905細(xì)胞的端粒酶活性，有效的誘導(dǎo)其凋亡。盡管在二～五代未見明顯的凋亡峰，但細(xì)胞周期的分布發(fā)生了改變，與對(duì)照組相比較，各用藥組TJ905細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例增多，S期細(xì)胞比例減少，說明在此期間AZT還可通過阻滯TJ905細(xì)胞由G0/G1向S期過渡抑制其增殖。 經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各用藥組TJ905細(xì)胞P33<'INGlb> mRNA 的

9、相對(duì)灰度值均高于對(duì)照組，并隨用藥濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而相應(yīng)增高，各組之間以及同一濃度不同代數(shù)之間的比較均有顯著差異(P<0.01)。經(jīng)直線相關(guān)分析證實(shí)，第六代中各組P33<'INGlb> mRNA相對(duì)灰度值與克隆形成率和Ki-67 LI％呈顯著負(fù)相關(guān) (r=-0.994～0.990，p<0.01)與原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記的和單細(xì)胞彗星電泳檢測(cè)的AI％呈顯著正相關(guān)(r=0.996～0.999，p<0.01)。說明AZT通過抑制端粒酶活性能上調(diào)

10、P33<'INGlb>bmRNA的表達(dá)水平從而發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡作用。 結(jié)論： 1．端粒酶異常再活化是惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞無限增殖和凋亡抑制的根本原因，端粒酶抑制劑 AZT 能有效的抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(TJ905 細(xì)胞)的端粒酶活性，其抑制作用呈劑量依賴性關(guān)系。 2．抑制TJ905細(xì)胞的端粒酶活性后，能上調(diào)該細(xì)胞系的P33<'INGlb>(抑癌基因ING1 的編碼產(chǎn)物) 表達(dá)，其表達(dá)水平與AZ

11、T用藥濃度成正比。 3．抑制TJ905細(xì)胞的端粒酶活性后，可阻滯腫瘤細(xì)胞由G0/G1向S期過渡，有效的抑制了該細(xì)胞系的增殖活性，并誘導(dǎo)其成熟分化和衰老凋亡。 4．各用藥組的p33<'INGlb>表達(dá)水平隨AZT用藥濃度增加而依次遞增，與腫瘤細(xì)胞的克隆形成率及Ki-67標(biāo)記指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤細(xì)胞的凋亡標(biāo)記指數(shù)呈正相關(guān)。 5．以上結(jié)果說明，端粒酶再活化可通過直接或間接抑制P33<'INGlb>表達(dá)，促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)