“GLI-miR-124-AURKA”調(diào)控模型的構(gòu)建及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用.pdf

1、研究背景:
　　Hedgehog信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在生殖細(xì)胞中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活往往造成發(fā)育過程紊亂;在體細(xì)胞中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?；罨瘎t往往伴隨多種癌癥的發(fā)生。腫瘤是在遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用下,細(xì)胞周期紊亂和細(xì)胞生長(zhǎng)失控所致的一類疾病。大量研究表明:腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵在于腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄失控。某些蛋白作為反式作用因子( trans acting factors)與其他基因

2、的順式作用元件( cis acting elements)相互作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。因此,深入研究腫瘤相關(guān)基因的反式作用因子有助于我們了解腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　轉(zhuǎn)錄因子GLI(Glioma-associated oncogene transcription factors, GLI)位于Hh信號(hào)通路級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)的末端,是通路上的關(guān)鍵調(diào)控因子,在信號(hào)傳導(dǎo)中起樞紐作用。研究表明GLI功能異?？赡軈⑴c多種腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展,但調(diào)控機(jī)制有待明晰。有研究報(bào)道抑制GLI能降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖與侵襲能力,基因芯片結(jié)果也證實(shí)GLI抑制的癌細(xì)胞中microRNAs的表達(dá)發(fā)生類似改變,提示受其調(diào)控的microRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤形成及發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。
　　研究目的:
　　1.本課題以 GLI為研究靶標(biāo),根據(jù)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)具有GLI結(jié)合元件的microRNAs,結(jié)合基因芯片數(shù)據(jù),采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot等手段,證明

4、miR-124為受GLI調(diào)控的microRNA,并確定AURKA為其下游靶基因,從而建立“GLI/miR-124/AURKA”信號(hào)軸。
　　2.研究與神經(jīng)膠質(zhì)瘤密切相關(guān)的microRNAs,特別是miR-124的功能,從分子、細(xì)胞和臨床水平三個(gè)層面分別驗(yàn)證“GLI/miR-124/AURKA”信號(hào)軸的正確性,揭示“GLI/miR-124/AURKA”信號(hào)軸與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)系,豐富Hh-GLI信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制,為尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤診療

5、新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1.前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)在GANT61處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中許多重要信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變,利用生物信息學(xué)方法對(duì)在 GLI抑制條件下的差異表達(dá)基因進(jìn)行 GLI結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)存在一定數(shù)量的差異表達(dá)基因不含有已知的GLI蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合區(qū)域,因此我們提出“轉(zhuǎn)錄因子/microRNAs/間接靶基因”的調(diào)控模型。
　　2.利用特異性小分子抑制劑下調(diào) GLI的表達(dá)后,通過

6、基因芯片技術(shù)分析microRNAs表達(dá)譜變化;同時(shí)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)的microRNAs進(jìn)行歸類分析;采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)富集于某些信號(hào)通路的差異microRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。通過分析microRNAs表達(dá)譜芯片發(fā)現(xiàn),經(jīng)GANT61處理后的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,miR-519a、miR-335和miR-124等microRNAs表達(dá)水平升高,經(jīng)過多重驗(yàn)證后,我們優(yōu)先選取miR-124進(jìn)行后續(xù)的功能研究。
　　3.采用多個(gè)數(shù)

7、據(jù)庫(TargetScan算法、基于序列互補(bǔ)的miRanda、基于熱力學(xué)模型的PicTar)預(yù)測(cè),結(jié)合基因芯片差異表達(dá)譜結(jié)果分析,選定AURKA作為miR-124的下游靶基因,電轉(zhuǎn)染法高表達(dá)miR-124后檢測(cè)下游靶基因的變化(包括mRNA水平和蛋白水平等方面),對(duì)受microRNAs調(diào)控的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　4.在H4細(xì)胞中,通過GLI的特異性抑制劑GANT61處理、干擾質(zhì)粒下調(diào)GLI2和高表達(dá)miR-124等手段,檢測(cè)相應(yīng)組

8、分的mRNA水平及蛋白水平的變化情況,驗(yàn)證并確立“GLI/miR-124/AURKA”信號(hào)軸的正確性,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)信號(hào)軸對(duì)細(xì)胞周期的影響。
　　5.在臨床樣本水平上,通過免疫組化法以及 Western Blot法檢測(cè) GLI2與AURKA的表達(dá)水平,分析二者相關(guān)性,揭示出“GLI/miR-124/AURKA”信號(hào)軸在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。
　　研究結(jié)果:
　　1. Hedgehog信號(hào)通路中存在“GLI