人腦脊液對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、凋亡及遷移特性的影響.pdf

1、對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種難治性疾病而言，間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞被認(rèn)為是理想的細(xì)胞資源，這兩類細(xì)胞具有促進(jìn)組織修復(fù)、攜帶特殊靶向藥物、對損傷部位定向遷移的能力。然而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的影響下，這些細(xì)胞資源原有的特殊性能是否會發(fā)生變化，目前尚不十分清楚。由于腦脊液是構(gòu)成人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的重要組成部分，因此研究這兩類細(xì)胞在腦脊液的環(huán)境下，其特性的改變，將對于干細(xì)胞用于中樞系統(tǒng)的臨床試驗(yàn)至關(guān)重要。本研究主要探索人腦脊液對人類脂肪間充質(zhì)干

2、細(xì)胞及胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移等方面的影響，從而為優(yōu)化干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用提供參考。
　　本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 人腦脊液對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　目的：觀察人腦脊液（Human cerebrospinal fluid,H-CSF）對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells

3、，hAMSCs）及胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞（human fetal-derived neural progenitor cells，hfNPCs）增殖及凋亡的影響。
　　方法：收集正常顱內(nèi)壓腦積水（normal pressure hydrocephalus）或先天性腦積水（congenital hydrocephalus）病人的腦脊液（H-CSF），同時(shí)配制人工腦脊液（Artificial cerebrospinal fluid，A-CS

4、F）。用100％MSC完全培養(yǎng)基（對照組，Ctrl）、25％A-CSF+75％MSC完全培養(yǎng)基（人工腦脊液組，A-CSF）以及25％H-CSF+75％MSC完全培養(yǎng)基（人腦脊液組，H-CSF）培養(yǎng)hAMSCs；用100％NPC完全培養(yǎng)基（對照組，Ctrl）、25％A-CSF+75％NPC完全培養(yǎng)基（人工腦脊液組，A-CSF）以及25％ H-CSF+75％ NPC完全培養(yǎng)基（人腦脊液組，H-CSF）培養(yǎng)hfNPCs。用MTT、免疫熒光染色

5、（Ki67）測定hAMSCs和hfNPCs的增值能力；用流式細(xì)胞檢測Propidium iodide（PI）和Annexin V，并而分析兩類細(xì)胞的凋亡比例。
　　結(jié)果：與Ctrl和A-CSF相比，hAMSCs在H-CSF環(huán)境下，增殖力能明顯增加（MTT assay,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05;Ki67 assay,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05;H-CSF

6、vs.A-CSF:p<0.05），凋亡比例下降（H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。同時(shí)，相對于Ctrl和A-CSF組，H-CSF可增加hfNPCs的增殖能力（MTT assay,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05;Ki67 assay,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05），降低其凋亡比

7、例（H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。此外，用不同濃度的H-CSF（0％，25％，50％，75％，100％）培養(yǎng)hAMSCs和hfNPCs，其增殖能力有所不同。
　　結(jié)論：H-CSF可促進(jìn)hAMSCs及hfNPCs的增殖，并抑制兩類細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分 人腦脊液對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞運(yùn)動及遷移的影響
　　目的：探討H-CSF對hAMSCs及h

8、fNPCs運(yùn)動速度、運(yùn)動距離以及遷移能力的影響及其相關(guān)特點(diǎn)。
　　方法：將hAMSCs及hfNPCs在不同條件下（Ctrl，A-CSF及H-CSF）培養(yǎng)，并種植于底面為納米材料的小憩室內(nèi)，動態(tài)觀察兩類細(xì)胞的運(yùn)動速度和運(yùn)動距離。用MATLAB軟件分析不同培養(yǎng)條件對hAMSCs和hfNPCs運(yùn)動能力的影響。同時(shí)用Boyden transwell chambers實(shí)驗(yàn)測定兩類細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下，對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma

9、,GBM）條件培養(yǎng)基的遷移能力，并分析H-CSF對hAMSCs和hfNPCs遷移能力的影響。
　　結(jié)果：通過對兩類細(xì)胞在納米材料表面的運(yùn)動狀態(tài)的觀察，并利用MATLAB軟件分析hAMSCs和hfNPCs的速度和距離。發(fā)現(xiàn)，相對Ctrl和A-CSF組，H-CSF可增加hAMSCs的運(yùn)動速度和運(yùn)動距離（speed,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05; H-CSF vs.A-CSF: p<0.05;distance,H-CSF v

10、s.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。同時(shí)H-CSF對hfNPCs的運(yùn)動能力亦有促進(jìn)作用（speed,H-CSF vs.Ctrl: p<0.05; H-CSF vs.A-CSF: p<0.05;distance, H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05）。通過Boyden transwell chambers實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H-CSF可提高h(yuǎn)AMSCs和 hfN

11、PCs的對GBM條件培養(yǎng)基的遷移能力（hAMSCs,H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs. A-CSF: p<0.05;hfNPCs, H-CSF vs.Ctrl:p<0.05;H-CSF vs.A-CSF:p<0.05)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在預(yù)處理時(shí)間一定的情況下（48hours），培養(yǎng)基中H-CSF的濃度越高，hAMSCs和hfNPCs對GBM條件培養(yǎng)基的遷移能力越強(qiáng)。
　　結(jié)論：H-CSF可提高h(yuǎn)AMS

12、Cs及hfNPCs的運(yùn)動速度和運(yùn)動距離，并可促進(jìn)hAMSCs和hfNPCs的遷移能力。
　　第三部分 人腦脊液中IGF-1對人類脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和胎兒神經(jīng)前體細(xì)胞特性的影響
　　目的：探討H-CSF中胰島素樣生長因子1（IGF-1）對hAMSCs及hfNPCs特性的影響及其機(jī)制。
　　方法：測定所收集H-CSF標(biāo)本中IGF-1的含量，并用IGF-1拮抗劑（IGF-1 inhibitor）拮抗H-CSF中的IGF-1。將

13、hAMSCs及hfNPCs在不同條件下（Ctrl， Ctrl+IGF-1 inhibitor，H-CSF及H-CSF+IGF-1 inhibitor）培養(yǎng)，觀察hAMSCs及hfNPCs的增殖、凋亡、運(yùn)動及遷移能力，并探討其部分機(jī)制。
　　結(jié)果：H-CSF中的IGF-1可影響hAMSCs和hfNPCs的增殖能力及凋亡比例。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)IGF-1 inhibiotr加入H-CSF時(shí)，hAMSCs及hfNPCs的增殖能力相對未加

14、入IGF-1 inhibitor組（H-CSF組）明顯下降（hAMSCs，H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05；hfNPCs，H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H-CSF中的IGF-1亦可影響 hAMSCs和hfNPCs的凋亡比例（hAMCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05;hfNPCs,H-C

15、SF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，H-CSF中的IGF-1可調(diào)控hAMSCs及hfNPCs的遷移能力，H-CSF+IGF-1 inhibitor組相對于H-CSF組而言，兩類細(xì)胞的遷移能力明顯降低（hAMCSs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF: p<0.05;hfNPCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05）。此

16、外，H-CSF+IGF-1 inhibitor相對于H-CSF組，其hAMSCs和hfNPCs細(xì)胞膜表面表達(dá)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子受體(Cxc Chemokin Receptor4,CXCR4)亦有下降（hAMSCs,H-CSF+IGF-1 inhibitor vs.H-CSF:p<0.05;hfNPCs,H-CSF+IGF-1 inhibitorvs.H-CSF:p<0.05）。
　　結(jié)論：H-CSF中的IGF-1可影響hAMSCs