FoxM1和PI3K-Akt信號通路在水飛薊賓誘導U87膠質(zhì)瘤細胞凋亡中的機制研究.pdf

1、目的：
　　水飛薊賓是從水飛薊中提取的一種活性成分，最初作為肝臟保護藥物廣泛應用于急慢性肝炎、肝硬化。近年來的研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓還具有廣泛的抗腫瘤作用。在體外及體內(nèi)多項實驗中證實，水飛薊賓可抑制包括前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌等在內(nèi)的多種惡性腫瘤。目前研究結(jié)果顯示水飛薊賓可通過調(diào)節(jié)細胞周期使腫瘤細胞生長阻滯、抑制腫瘤的增殖，還可通過下調(diào)VEGF及MMPs降低腫瘤侵襲和遷移能力，還可通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子誘導凋亡的發(fā)生，同時還能與其

2、他抗腫瘤藥物產(chǎn)生協(xié)同作用，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多重耐藥、增加化療藥物對腫瘤細胞的敏感性。
　　FoxM1屬于FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，廣泛存在于腫瘤細胞中，在增殖活躍細胞中高度表達，具有調(diào)控細胞周期的作用，可促使細胞過度增殖。近年的研究還發(fā)現(xiàn)FoxM1不僅參與了細胞周期調(diào)控，還通過調(diào)節(jié)其他靶基因的表達，從而參與細胞凋亡的調(diào)控。同時還發(fā)現(xiàn)多種抗腫瘤藥物都是以FoxM1為作用靶點，從而實現(xiàn)抑制增殖、誘導凋亡的抗腫瘤作用。
　　本實

3、驗研究首次證實了FoxM1為水飛薊賓的作用靶點，水飛薊賓通過作用于FoxM1從而抑制膠質(zhì)瘤的增殖、誘導凋亡。同時驗證了PI3K信號作為FoxM1的上游信號參與了FoxM1的調(diào)控，共同參與了水飛薊賓誘導膠質(zhì)瘤凋亡的過程，F(xiàn)oxM1可能參與了PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導的過程。
　　方法：
　　1、選擇人膠質(zhì)瘤細胞系U87進行體外培養(yǎng)，給予不同濃度的水飛薊賓作用后，通過Western Blot法檢測FoxM1的蛋白表達水平。通過

4、RNA干擾技術在U87膠質(zhì)瘤細胞中轉(zhuǎn)入shRNA-FoxM1質(zhì)粒，采用有限稀釋法篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。采用流式細胞技術檢測轉(zhuǎn)染shRNA-FoxM1后對U87細胞凋亡水平的影響，CCK-8法及胎盤蘭染色法檢測轉(zhuǎn)染shRNA-FoxM1對細胞增殖能力的影響，Western blot驗證沉默效率及轉(zhuǎn)染shRNA-FoxM1后對凋亡相關蛋白表達水平的影響。
　　2、分別給予PI3K、Akt的抑制劑，采用Western blot法檢測Fox

5、M1和Akt磷酸化蛋白的表達水平，明確PI3K/Akt信號通路對FoxM1的影響。在沉默F(xiàn)oxM1蛋白表達的基礎上聯(lián)合應用水飛薊賓和PI3K抑制劑，采用Western Blot檢測凋亡相關蛋白及FoxM1的表達水平，采用CCK-8法及胎盤藍染色法檢測細胞存活率，明確PI3K/Akt信號通路和FoxM1在水飛薊賓在抑制膠質(zhì)瘤增殖及誘導凋亡中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、水飛薊賓通過劑量、時間依賴方式抑制U87細胞的增殖

6、　　將不同濃度的水飛薊賓分別作用于U87細胞24小時、48小時和72小時，采用CCK-8法檢測細胞活力。結(jié)果顯示，隨著水飛薊賓的濃度增加和作用時問延長，其對U87細胞抑制程度隨之增加。
　　2、水飛薊賓誘導U87膠質(zhì)瘤細胞凋亡，其凋亡水平與藥物濃度成正比
　　與對照組相比，水飛薊賓可誘導U87膠質(zhì)瘤細胞凋亡，隨著水飛薊賓的藥物濃度的增加，U87細胞的凋亡水平也隨之增加。
　　3、水飛薊賓可下調(diào)FoxM1的蛋白表達水平，

7、其下調(diào)程度與藥物濃度相關
　　與對照組相比，隨著水飛薊賓藥物濃度的增加，U87細胞中的FoxM1蛋白表達水平也隨之下調(diào)。100μM水飛薊賓作用48小時即可顯著下調(diào)U87細胞中FoxM1的蛋白表達水平。
　　4、沉默F(xiàn)oxM1可抑制膠質(zhì)瘤增殖并誘導凋亡發(fā)生，在沉默F(xiàn)oxM1的基礎上聯(lián)合應用水飛薊賓可顯著的抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、誘導凋亡。
　　與對照組相比，沉默F(xiàn)oxM1可抑制U87膠質(zhì)瘤細胞增殖能力并誘導凋亡的發(fā)生。沉默F(xiàn)

8、oxM1的基礎上，應用100μM水飛薊賓作用48小時后可顯著的抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡。
　　5、沉默F(xiàn)oxM1蛋白表達水平后，可上調(diào)Cleaved-Caspase3和Bax蛋白表達水平，同時下調(diào)Caspase3和Bcl-2的蛋白表達水平。
　　通過Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，沉默F(xiàn)oxM1的表達水平可增加Cleaved-Caspase3和Bax的蛋白表達水平，同時降低Caspase3和Bcl-2的蛋

9、白表達水平。
　　6、PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin可下調(diào)U87膠質(zhì)瘤細胞中FoxM1的蛋白表達水平，而Akt抑制劑MK2206并不能改變FoxM1的蛋白表達水平。
　　分別給予PI3K和Akt的抑制劑，通過Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，給予PI3K抑制劑組均出現(xiàn)FoxM1的蛋白表達水平下調(diào)，而給予Akt抑制劑組的FoxM1蛋白表達水平無明顯變化。
　　7、沉默F(xiàn)oxM1的蛋白表達水平后，可下

10、調(diào)Akt的磷酸化水平。
　　8、在沉默F(xiàn)oxM1的蛋白表達基礎上聯(lián)合應用水飛薊賓和PI3K抑制劑，可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力
　　9、在沉默F(xiàn)oxM1的蛋白表達基礎上聯(lián)合應用水飛薊賓和PI3K抑制劑，可顯著上調(diào)凋亡蛋白Bax、Cleaved-Caspase3的蛋白表達水平，下調(diào)凋亡抑制蛋白Caspase3、Bcl-2的蛋白表達水平
　　結(jié)論：
　　1、水飛薊賓以時間、劑量依賴方式抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，并誘導凋亡