人臍帶間充質(zhì)干細胞對急性早幼粒細胞白血病細胞分化功能影響的研究.pdf

1、背景：
　　 急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)M3是急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia, AML）的一種具有獨特生物學和臨床特性的亞型。由于特征性的15號和17號染色體異位產(chǎn)生的PML/RARa融合蛋白導致造血干細胞分化受阻于異常的早幼粒階段。雖然眾多研究表明全反式維甲酸(all-trans retinoicacid，ATRA)能夠誘導APL

2、早幼粒細胞分化，并且在幾乎所有的病人能夠達到疾病的完全緩解，ATRA的應用由于其難以避免的毒性和獲得性耐藥而受限制。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一類具有自我更新(self renewal)和多向分化潛能(multi-lineage differentiation)的成體干細胞，可以分泌豐富的造血生長因子。研究表明MSC在體內(nèi)外均能促進正常的造血干細胞向髓系和淋系分化，而關(guān)于MSC對白血病細胞的分

3、化影響未見有報道，值得進一步研究。
　　 目的：
　　 研究臍帶來源的間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchyma stem cells,UC-MSC)對急性早幼粒細胞白血病細胞系NB4細胞和M3病人骨髓來源的白血病細胞分化的影響及可能的機制，為間充質(zhì)干細胞應用于腫瘤治療提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 利用酶消化法從足月妊娠剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶，通過貼壁法取得原代培養(yǎng)的

4、細胞，消化傳代后，取P4-P6代的細胞。UC-MSC與NB4細胞和APL病人骨髓來源的白血病細胞建立共培養(yǎng)體系，通過細胞形態(tài)，硝基四唑氮藍還原試驗(nitroblue tetrozolium reduction test，NBT)和細胞表面粒系分化標志CD11b的檢測評價腫瘤細胞的分化狀態(tài)。設(shè)立NB4對照組，UC-MSC處理組，ATRA處理組和UC-MSC+ATRA共同處理組4個組，于培養(yǎng)的24小時,48小時，72小時進行NBT試驗和C

5、D11b表型檢測，于培養(yǎng)72小時瑞氏染色觀察細胞形態(tài)；于培養(yǎng)48小時碘化丙啶(propidium iodide，PI)摻入法流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布；用膜孔直徑為0.4um的Transwell隔離UC-MSC與NB4細胞后共培養(yǎng)48小時后檢測分化標志CD11b的表達；用實時PCR技術(shù)檢測的細胞分化相關(guān)的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，原癌基因c-Myc，核轉(zhuǎn)錄因子C/EBPp和C/EBPε的mRNA轉(zhuǎn)錄水平；檢

6、測共培養(yǎng)體系中IL-6因子的濃度變化情況，用IL-6Ra中和抗體阻斷IL-6和其相應受體的結(jié)合，并用外源性重組人IL-6來刺激白血病細胞來鑒定IL-6在白血病細胞分化中所發(fā)揮的作用。用實時PCR技術(shù)檢測UC-MSC和NB4細胞內(nèi)IL-6mRNA水平的變化來鑒定共培養(yǎng)體系IL-6的來源；用Western blot的方法檢測了UC-MSC對白血病腫瘤細胞內(nèi)MEK/ERK信號通路的活化狀態(tài)，用MEK/ERK信號通路抑制劑PD98059（MEK

7、1抑制劑），U0126(MEK1/2非選擇性抑制劑)，和p38信號通路抑制劑SB203580觀察MEK/ERK信號通路和p38信號通路的阻斷在UC-MSC促進白血病細胞分化過程中所起的作用；用PD98059和U0126阻斷MEK/ERK信號通路后檢測IL-6對腫瘤細胞表面分化標志CD11b的影響來推斷IL-6發(fā)揮作用可能的信號通路。
　　 結(jié)果：
　　 UC-MSC在體外能夠誘導NB4細胞和M3病人骨髓來源的白血病細胞向

8、粒系分化成熟并和小劑量ATRA共同作用時存在聯(lián)合增強；誘導細胞分化的同時伴有G0/G1周期阻滯，MPO和c-Myc mRNA水平下調(diào)，C/EBPβ和C/EBPεmRNA水平上調(diào)；Transwell實驗證明UC-MSC通過可溶性因子發(fā)揮促白血病細胞分化作用：共培養(yǎng)體系中IL-6濃度明顯上調(diào)，IL-6Ra中和阻斷IL-6作用后可部分逆轉(zhuǎn)UC-MSC的促分化作用，外源性IL-6對NB4細胞亦發(fā)揮促粒系分化作用，證實UC-MSC至少是部分通過分

9、泌IL-6發(fā)揮促白血病細胞分化作用；UC-MSC促進NB4細胞內(nèi)MEK/ERK信號通路的活化，阻斷MEK/ERK信號通路可阻斷UC-MSC促分化作用，阻斷MEK/ERK信號通路亦可阻斷IL-6促分化作用，說明UC-MSC至少部分通過分泌IL-6激活白血病細胞內(nèi)的MEK/ERK信號通路發(fā)揮促進分化作用。
　　 結(jié)論：
　　 UC-MSC可以促進急性早幼粒白血病細胞向粒系分化成熟，且和小劑量ATRA同時應用可以達到作用聯(lián)合增

10、強；其內(nèi)在機制部分是通過分泌IL-6激活白血病細胞內(nèi)MEK/ERK信號通路。
　　 課題二胰腺干／祖細胞表面標志的研究
　　 背景：
　　 糖尿病(diabetes mellitus，DM)及其并發(fā)癥的死亡率已上升至繼心血管疾病、腫瘤之后的第三位，嚴重威脅人類的健康。隨著胰島移植技術(shù)的發(fā)展，β細胞替代治療成為徹底治療糖尿病最有希望的方法。但是供體胰腺的不足限制了胰島移植的廣泛開展。因此，我們迫切需要尋找β細胞的新

11、來源，胰腺干／祖細胞研究為細胞治療糖尿病提供了基礎(chǔ)。胰腺干／祖細胞的研究起步較晚，對其來源，特征研究甚少，如何利用新的表面標志高效分離胰腺干／祖細胞更無人研究。為了更有效地分離出胰腺干／祖細胞，我們需要進一步尋找其表面標志。
　　 目的：
　　 明確胚胎胰腺是否表達Stem cell antigen-1(Sca-1)，和c-Kit等造血干細胞的標志，表達的時間及位置，是否共表達胰腺干細胞的標志腺十二指腸同源盒基因1(PD

12、X-1)，神經(jīng)源素3(neurogenin3，Ngn3)及B細胞的標志胰島素(insulin)。
　　 方法：
　　 體外分離小鼠12.5天，15.5天和17.5天的胚胎胰腺。實時定量PCR技術(shù)檢測胰腺細胞Sca-1和c-kit的mRNA的表達；不同孕天的胚胎胰腺體外消化成單細胞懸液后，流式細胞術(shù)檢測其細胞膜表面Sca-1和c-kit的表達；熒光免疫組織化學檢測胰腺細胞是否表達Sca-1和c-Kit，以及Sca-1和c-

13、Kit是否共表達胰腺十二指腸同源PDX-1，Ngn3及胰島素；免疫磁珠分選(magnet activated cell sorting，MACS)出Sca-1或c-kit陽性和陰性細胞亞群，體外培養(yǎng)分離的Sca-1和c-Kit陽性和陰性細胞群，檢測各種細胞亞群分化為成熟內(nèi)分泌細胞的潛能，是否分泌胰島素，確定何種細胞亞群分化為成熟β細胞的潛能最大。
　　 結(jié)果：
　　 小鼠胚胎胰腺表達造血干細胞的標志Sca-1和c-Kit

14、，表達呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的趨勢，在孕齡15.5天的時候，其表達達高峰；c-Kit與胰腺干／祖細胞的標志PDX-1，Ngn3及β細胞的標志胰島素的在不同時期存在共表達，而Sca-1不與胰腺干／祖細胞的標志及β細胞的標志共表達；磁珠分選c-Kit陽性細胞群在體外培養(yǎng)分化成的內(nèi)、外分泌細胞顯著多于c-kit陰性細胞；c-kit陽性細胞分化的B細胞能夠分泌胰島素，而且高糖能刺激胰島素分泌。
　　 結(jié)論：
　　 小鼠胚胎胰腺表達造血