神經(jīng)生長(zhǎng)因子在子宮腺肌病疼痛中的作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、子宮腺肌病是一種子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層,伴隨子宮局灶或彌漫性增大的良性疾病。此病多發(fā)生于40歲以上的經(jīng)產(chǎn)婦,患病率為5％～70％,子宮切除后腺肌病灶的檢出率約為30％～60％。臨床表現(xiàn)主要為經(jīng)量增多和經(jīng)期延長(zhǎng),以及逐漸加劇的進(jìn)行性痛經(jīng)。子宮腺肌病患者的痛經(jīng)率高達(dá)64.8％～77.8％,此外還可以出現(xiàn)慢性盆腔痛、排便痛及性交痛。疼痛嚴(yán)重影響了女性的生殖健康和生活質(zhì)量,但其機(jī)制尚未完全明確。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth f

2、actor,NGF)是一類在疼痛過程中起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)因子,主要通過低親和力的P75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)與高親和力的酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase A,trkA)發(fā)揮生物學(xué)作用,參與疼痛發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)。研究表明NGF在內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜高表達(dá),且與疼痛相關(guān),可能成為內(nèi)異癥及腺肌病疼痛研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　本課題檢測(cè)NGF在腺肌病患者或動(dòng)

3、物模型子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)變化,研究NGF表達(dá)與腺肌病本身及疼痛程度的關(guān)系,分析可能誘發(fā)NGF變化的原因,并通過檢測(cè)NGF相關(guān)的神經(jīng)植入、疼痛受體、局部炎癥、中樞敏感性的變化,及NGF對(duì)腺肌病灶內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡、雌激素合成關(guān)鍵酶表達(dá)的作用,探討NGF參與子宮腺肌病疼痛的機(jī)制。
　　第一部分:子宮腺肌病患者腺肌灶NGF表達(dá)與神經(jīng)植入及疼痛程度的關(guān)系
　　目的:研究NGF在子宮腺肌病患者病灶內(nèi)膜的表達(dá)及其與患者疼痛評(píng)

4、分及病灶局部神經(jīng)植入密度的關(guān)系。
　　方法:選擇2009年3月～10月在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院院行子宮切除的腺肌病患者45例,子宮切除且否認(rèn)疼痛的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅲ期及子宮肌瘤患者共26例,所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)確診。于術(shù)中取腺肌病患者病灶內(nèi)膜或子宮肌瘤及CIN患者在位內(nèi)膜,免疫組化法顯示神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)表達(dá);免疫熒光法顯示蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入;視覺評(píng)分系統(tǒng)(VAS)評(píng)測(cè)腺肌病患者痛經(jīng)、

5、慢性盆腔痛及性交痛的程度。
　　結(jié)果:腺肌病疼痛組患者病灶NGF表達(dá)強(qiáng)度及PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入密度高于腺肌病無痛組及對(duì)照組(p＜0.05);腺肌病痛經(jīng)重痛組NGF表達(dá)強(qiáng)度及PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入密度高于腺肌病痛經(jīng)輕中痛組及對(duì)照組(p＜0.05);NGF表達(dá)強(qiáng)度及PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入密度與腺肌病患者是否出現(xiàn)慢性盆腔痛及性交痛無關(guān);腺肌病患者病灶NGF表達(dá)強(qiáng)度與PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維密度變化具有相關(guān)性(r=0.

6、31,p＜0.05)。
　　結(jié)論:腺肌病患者病灶處NGF高表達(dá)可能參了患者痛經(jīng)的發(fā)生機(jī)制,而促進(jìn)病灶內(nèi)膜神經(jīng)纖維植入是其機(jī)制之一。
　　第二部分:NGF及其受體在子宮腺肌病小鼠子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)的表達(dá)
　　目的:使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宮腺肌病模型并鑒定;檢測(cè)NGF及其受體在腺肌病小鼠模型子宮及脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)的表達(dá)隨動(dòng)情周期及病情進(jìn)展的變化。
　　方法:新生ICR小鼠連續(xù)4d滴喂他莫昔芬為

7、造模組,并與同齡對(duì)照小鼠分別于42d、85～95d、135～145d、185～195d、235～245d齡處死(每組4～5只),取雙子宮及T13至L2脊髓背根神經(jīng)節(jié)。使用蘇木素-伊紅染色檢測(cè)子宮病理改變;陰道脫落細(xì)胞法檢測(cè)動(dòng)情周期變化;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)子宮緩激肽受體1(BKR-1)、神經(jīng)激肽1受體(NK1-R)的基因表達(dá);免疫組化補(bǔ)體31(CD31)染色計(jì)算子宮微血管的密度、直徑及所占面積比;免疫組化PGP9.5

8、及SP染色計(jì)算神經(jīng)纖維密度;免疫組化檢測(cè)NGF及其受體在子宮的表達(dá);蛋白印跡(Western-bolt)檢測(cè)子宮NGF及其受體蛋白水平隨動(dòng)情周期及鼠齡增加的變化;實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timeRTPCR)檢測(cè)DRGs中NGF受體mRNA水平隨鼠齡增加的變化。
　　結(jié)果:使用口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宮腺肌病模型的造模率為100％,且疾病嚴(yán)重程度隨鼠齡增加進(jìn)展;85～95d及135～145d齡造模小鼠子宮肌層微血

9、管密度和面積比均高于對(duì)照小鼠(p＜0.05);135～145d造模小鼠子宮內(nèi)膜及肌層PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)纖維、內(nèi)膜SP陽(yáng)性神經(jīng)纖維植入密度高于對(duì)照組(p＜0.05);135～145d造模小鼠子宮BKR-1、NK1-R的基因表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(p＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示NGF在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),p75NTR在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞表達(dá),trkA在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及神經(jīng)纖維表達(dá);Western-bolt結(jié)果表明135～1

10、45d腺肌病鼠及對(duì)照鼠子宮NGF及其受體的表達(dá)隨動(dòng)情周期變化波動(dòng),NGF及p75表達(dá)水平在動(dòng)情前期達(dá)高峰,trkA在動(dòng)情期達(dá)高峰(p＜0.05);85～95d腺肌病小鼠NGF及其受體表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組無差異,135～145d腺肌病小鼠子宮出現(xiàn)NGF前體及p75NTR表達(dá)增高(p＜0.05),且隨鼠齡增長(zhǎng)腺肌病鼠子宮NGF、NGF前體及NGF受體的蛋白水平(p＜0.05),DRGs中trkA的mRNA水平均增高(p＜0.05),對(duì)照鼠未見此

11、變化。
　　結(jié)論:口服他莫昔芬法可有效建立ICR小鼠子宮腺肌病模型,模型小鼠出現(xiàn)腺肌病特征性病理改變及血管、神經(jīng)、炎癥、疼痛相關(guān)受體的表達(dá)異常,病情隨鼠齡進(jìn)展:腺肌病及對(duì)照小鼠子宮NGF及受體的表達(dá)受動(dòng)情周期調(diào)節(jié),隨疾病進(jìn)展增強(qiáng);腺肌病小鼠DRGs中trkA表達(dá)增強(qiáng)可能是中樞神經(jīng)敏感性增強(qiáng)的原因之一;腺肌病子宮NGF表達(dá)與BKR-1及NK1-R所反映的局部組織、神經(jīng)炎癥變化一致。
　　第三部分:腺肌病患者異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NG

12、F表達(dá)的影響因素及其對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用研究
　　目的:研究影響腺肌病患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NGF表達(dá)的因素及NGF對(duì)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡、雌激素合成的作用。
　　方法:選擇2009年5月～10月在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院院行子宮切除的腺肌病患者為實(shí)驗(yàn)組,子宮切除宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅲ期及子宮肌瘤患者為對(duì)照組。于術(shù)中取實(shí)驗(yàn)組病灶內(nèi)膜或?qū)φ战M在位內(nèi)膜分離子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(ESC)并行原代培養(yǎng)。免疫組化法顯示ESC的NGF

13、及其受體表達(dá);于培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度17β-雌二醇、腫瘤壞死因子(TNF)及氯化鈷(CoCl2),western-bolt檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組ESC合成NGF蛋白水平的變化;于培養(yǎng)體系中加入不同濃度NGF,MTT法檢測(cè)兩組ESC增殖變化,tealtimeRT-PCR與western-bolt法分別檢測(cè)兩組ESC合成芳香化酶的mRNA及蛋白水平變化;培養(yǎng)體系中加入H2O2或CoCl2誘導(dǎo)ESC凋亡并加入不同濃度NGF,MTT法檢測(cè)ES

14、C凋亡變化。
　　結(jié)果:腺肌病及對(duì)照組ESC均表達(dá)NGF及其受體p75NTR,均不表達(dá)trkA。外源性17β-雌二醇可促進(jìn)腺肌病ESC合成NGF,但對(duì)對(duì)照組ESC無此作用;外源性TNF可促進(jìn)腺肌病組與對(duì)照組NGF的合成;CoCl2缺氧可降低對(duì)照組ESC合成NGF,但對(duì)腺肌病ESC無此作用;外源性NGF可明顯促進(jìn)腺肌病ESC增殖及芳香化酶的合成,但對(duì)對(duì)照組ESC無此作用;外源性NGF對(duì)兩組ESCH2O2及CoCl2誘導(dǎo)的凋亡均無保護(hù)