沙眼衣原體抗菌素耐藥及治療失敗的評估.pdf

1、目的：探討對泌尿生殖道沙眼衣原體臨床株進行多次傳代培養(yǎng)的意義；檢測本地區(qū)近年來泌尿生殖道沙眼衣原體對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗菌素的體外藥物敏感性；篩查耐藥株，并從基因水平上探討其耐藥機制；評價藥敏結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性，評估抗菌素耐藥與臨床治療失敗。
　　 方法：培養(yǎng)McCoy細胞至孔板中，置于37℃、5％CO2溫箱中孵育，18～24h后生長至致密單層后，接種沙眼衣原體標準株和臨床株，培養(yǎng)48～72h后，用盧戈氏碘液染色

2、鑒定培養(yǎng)結(jié)果，凡是培養(yǎng)陰性的標本繼續(xù)傳代培養(yǎng)至五代。為評估多次傳代后培養(yǎng)法的敏感性，選用沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒基因片段為引物，PCR擴增檢測沙眼衣原體；42株陽性標本傳代培養(yǎng)至感染率達90％以上，收集標本進行9種常用抗菌素的藥敏試驗。核酸擴增臨床分離株的omp1基因并用AluⅠ、MspⅠ雙酶切進行基因分型。PCR方法擴增檢測四環(huán)素耐藥質(zhì)粒tetM基因；同時用RT-PCR，PCR方法分別擴增與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)的23S核蛋白體RNA基因、核

3、糖體蛋白基因L4，通過產(chǎn)物測序檢測基因突變；限制性片段分析（RFLP）檢測gyrA喹諾酮耐藥決定區(qū)（Quinolone-Resistance Determining Region，QRDR）常見的基因點突變。統(tǒng)計方法：試驗結(jié)果采用卡方檢驗和Spearman相關(guān)性分析，確定檢驗水準a=0.05，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件計算卡方值、相關(guān)系數(shù)，確定P值，P<0.05即有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：299例樣本中細胞培養(yǎng)法共檢測到10

4、4株陽性標本，陽性率為34.78％。初次培養(yǎng)（原代）陽性率5.69％，傳代一次后（二代）陽性率為20.07％，傳代兩次后（三代）陽性率為33.44％，傳代三次后（四代）陽性率為34.78％，傳代四次后（五代）陽性率仍為34.78％。前三代隨著傳代，陽性例數(shù)及陽性率明顯增加，而四代、五代基本上處于穩(wěn)定趨勢。PCR擴增檢測結(jié)果除了24例培養(yǎng)法檢測陰性而PCR法檢測為陽性的標本外，余與細胞培養(yǎng)法完全一致。臨床標本細胞培養(yǎng)檢測結(jié)果與臨床療效之間

5、存在關(guān)聯(lián)性（x2=8.242，P=0.004<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。臨床治療成功的標本更易于細胞培養(yǎng)，治療失敗的標本不易于細胞培養(yǎng)檢測，隨著多次傳代培養(yǎng)，陽性率明顯增加。藥敏MIC（單位均為mg/L）結(jié)果分別為紅霉素：0.5～2，克拉霉素：0.008～0.032，阿奇霉素：0.125～0.5，四環(huán)素：0.157～0.625，多西環(huán)素：0.063～0.125，米諾環(huán)素：0.032～0.128，左氧氟沙星：0.5～1，莫西沙星：0.

6、06～0.12，司帕沙星：0.064～0.128，其中發(fā)現(xiàn)2株紅霉素耐藥株（MIC值：2mg/L），其23s rRNA基因有C2452A、T2611C的突變（大腸桿菌序列編號），紅霉素耐藥株及敏感株L4基因均發(fā)現(xiàn)脯氨酸113（CCG）→亮氨酸（CTG）、脯氨酸156（CCC）→丙氨酸（GCC）兩個位點的突變（GenBank NC000117.1），25株臨床分離株中檢測到tetM基因，未發(fā)現(xiàn)gyrA-QRDR-基因中Ser83→Ile點

7、突變。將42株臨床分離株進行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株為D型，余均為E型。
　　 結(jié)論：傳代培養(yǎng)可以明顯提高臨床株沙眼衣原體的檢出率，盲傳一次的檢驗標準有一定的漏診率，臨床株應傳代培養(yǎng)至三代，其培養(yǎng)的成功將為實驗室開展該病原體的致病機理、免疫機制、體外藥物敏感性檢測、耐藥機制和保護性疫苗等方面的研究奠定基礎。隨著時間的推移，抗菌素的敏感性呈不同程度的下降，克拉霉素體外抗沙眼衣原體活性最強。米諾環(huán)素，司帕沙星、莫西沙星等均有較強的抗沙

8、眼衣原體感染活性，但其MIC值較以往文獻報道增高。C2452A、T2611C的突變導致紅霉素低水平耐藥，L4基因的點突變可能與紅霉素耐藥無關(guān)，tetM基因陽性率（59.2％）較高，表明體內(nèi)對四環(huán)素敏感性普遍降低。喹諾酮類實驗室突變株可能在臨床株中并不常見。沙眼衣原體對抗菌素的耐藥機制有待進一步研究。E型為沙眼衣原體的優(yōu)勢基因型。以細胞培養(yǎng)法為基礎的體外藥敏試驗與臨床療效之間存在差異。臨床治療失敗影響培養(yǎng)結(jié)果，沙眼衣原體抗菌素耐藥可引起臨