進一步降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的實驗及臨床研究.pdf

1、第一部分進一步降低肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的實驗研究
　　 第一章SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及標(biāo)記
　　 目的：
　　 探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記。
　　 方法：
　　 通過密度梯度離心法和貼壁法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。用流式細胞儀通過細胞的表面抗原對細胞進行鑒定，并采用Brdu進行標(biāo)記。
　　 結(jié)論：
　　 采用密度梯度離心法和貼壁法分

2、離SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞簡單易行，細胞純度較高，經(jīng)流式細胞儀鑒定，確定為骨髓間充質(zhì)干細胞。采用Brdu標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細胞，簡單、可行，便于進一步深入研究。
　　 第二章攜帶VEGF165的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞
　　 目的：
　　 用攜帶VEGF165基因的腺病毒轉(zhuǎn)染MSC(mesenchymal stem cells)，并檢測目的基因VEGF165的表達情況，為下一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　

3、方法：
　　 腺病毒感染骨髓間充質(zhì)干細胞，進行基因轉(zhuǎn)染實驗。先用攜帶GFP的腺病毒感染細胞，轉(zhuǎn)染48小時后，通過熒光顯微鏡觀察細胞，并計算轉(zhuǎn)染效率，確定出最佳的感染倍數(shù)。根據(jù)最佳感染倍數(shù)，進行下一步實驗，MSC被隨機分為兩組：實驗組轉(zhuǎn)染攜帶VEGF165基因的腺病毒載體，對照組轉(zhuǎn)染空的病毒載體。通過ELISA、RT-PCR和Western blot法檢測VEGF165的表達情況，MTT法繪制轉(zhuǎn)染后的MSC的生長曲線。
　　

4、 結(jié)論：
　　 攜帶VEGF165腺病毒載體，能成功感染了MSC，當(dāng)MOI值在100時，感染效率接近90％，且對細胞的影響較小。感染后的MSC能夠表達目的蛋白VEGF，轉(zhuǎn)染組的細胞較對照組生長較快。
　　 第三章無心跳大鼠供肝膽道熱缺血再灌注損傷的安全時限
　　 目的：
　　 探討非肝素化的無心跳大鼠供肝不同的熱缺血時間與膽道缺血再灌注損傷之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 采用改良的重建

5、肝動脈的大鼠肝移植模型，供體采用無心跳，無肝素化的模型，按供肝的熱缺血時間的不同分別為0分鐘(WI0組)，10分鐘(WI10組)，15分鐘(WI15組)三組，每組36對大鼠。比較大鼠肝移植術(shù)后的生存率，膽道并發(fā)癥發(fā)生率，肝功能恢復(fù)情況以及病理改變情況。
　　 結(jié)論：
　　 非肝素化無心跳的大鼠供肝熱缺血時間超過15分鐘時，移植術(shù)后膽道損傷明顯，可導(dǎo)致不可逆改變。
　　 第四章攜帶VEGF165基因的骨髓間充質(zhì)干細

6、胞對無心跳大鼠供肝膽道熱缺血再灌注損傷修復(fù)的研究
　　 目的：
　　 觀察經(jīng)肝動脈輸注轉(zhuǎn)染VEGF165的MSC和單純的MSC，對大鼠無心跳供肝膽道熱缺血再灌注損傷的修復(fù)及血管生成情況，并比較聯(lián)合治療組與單獨細胞移植治療組之間的療效差異。
　　 方法：
　　 采用無肝素化、無心跳熱缺血供體模型和重建肝動脈的大鼠肝移植模型，供肝的熱缺血時間控制在15分鐘，隨后將大鼠隨機分為4組(每組24對)，行肝移植手術(shù)，

7、A組(聯(lián)合治療組)在術(shù)中由肝動脈輸注經(jīng)肝動脈注入轉(zhuǎn)染VEGF165的骨髓間充質(zhì)細胞懸液0.5ml(細胞數(shù)為3×106個/ml)，B組(細胞治療組)進行等量的MSC移植，C組(對照組)輸入PBS0.5ml。另取6只為假手術(shù)組(D組)。比較大鼠肝移植術(shù)后的生存率、肝功能恢復(fù)情況、體重、膽道并發(fā)癥發(fā)生率。1周時觀察MSC在肝臟的分布情況，2周時用RT-PCR及Western blot檢測VEGF在體內(nèi)的表達情況，2周時檢測膽管的增生情況，4周

8、時用八因子抗體行免疫組化檢測微血管密度，同時檢測膽管數(shù)目的多少，并行MASSON染色。
　　 結(jié)論：
　　 經(jīng)肝動脈輸注骨髓間充質(zhì)干細胞及轉(zhuǎn)染VEGF165的骨髓間充質(zhì)干細胞，能夠促進肝功能恢復(fù)，減少膽道并發(fā)癥，降低死亡率，通過促進血管生成及微循環(huán)得到明顯的改善，有利于膽道熱缺血再灌注損傷的修復(fù)，但聯(lián)合組的療效要好于單純細胞治療組，考慮可能與VEGF與骨髓間充質(zhì)干細胞之間的協(xié)同作用有關(guān)。
　　 第二部分進一步降低

9、肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的臨床研究
　　 第一章改良膽道重建技術(shù)在肝移植手術(shù)中的應(yīng)用
　　 目的：
　　 探討改良膽道重建技術(shù)在肝移植手術(shù)中應(yīng)用的可行性、優(yōu)勢。
　　 方法：
　　 回顧分析本院兩年間完成的131例肝移植患者的臨床資料。根據(jù)膽道重建方式的不同將其分為兩組：A組(n=76)為接受傳統(tǒng)膽道重建術(shù)的患者，B組(n=55)為接受改良膽道重建技術(shù)的患者。改良膽道重建最主要的特點是利用供肝獲取時的

10、膽囊灌注管或膽道重建時的膽道支架管，來改善膽道重建的條件，便于吻合且方便試漏。所有手術(shù)為同一組術(shù)者實施，且手術(shù)技術(shù)熟練。兩組患者在性別，年齡，手術(shù)指征及肝功能評分等方面均相似，具有可比性。比較兩組患者的膽道吻合時間，與吻合口相關(guān)的膽道并發(fā)癥等情況。
　　 結(jié)論：
　　 利用膽囊灌注管或膽道支架管并結(jié)合精細的顯微外科技術(shù)來改善膽道重建的方法是一種較理想的膽道重建方式，簡便易行，術(shù)后膽道并發(fā)癥少。
　　 第二章肝移植

11、術(shù)中復(fù)雜膽道重建的處理
　　 目的：
　　 探討肝移植中復(fù)雜膽道重建的方法及體會，提高膽道重建的技術(shù)。
　　 方法：
　　 對2007年到2009年的資料完整的9例復(fù)雜性膽道重建病例的臨床資料進行分析。9例患者中有手術(shù)史的患者有5例(55.6％)，其中膽道手術(shù)史的3例(33.33％)；活體肝移植2例(22.22％)；膽管癌1例(11.1％)；胰頭癌1例(11.1％)。評價膽道重建的時間，膽道重建的方式，術(shù)

12、中處理，術(shù)后并發(fā)癥等資料。
　　 結(jié)論：
　　 對于肝移植中復(fù)雜的膽道重建要做好充分的準(zhǔn)備，嫻熟的顯微外科技術(shù)及適當(dāng)?shù)闹亟ǚ绞椒浅Ｖ匾?，留置膽道支架管是安全、可行的?br>　　 第三章肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的診治體會
　　 目的：
　　 探討肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的診治體會。
　　 方法：
　　 對2007年到2009年的資料完整的23例肝移植術(shù)后不同類型的膽道并發(fā)癥的患者臨床資料進行分析