乏氧樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生Th2優(yōu)勢應(yīng)答的機(jī)制探討.pdf

1、傳統(tǒng)的腫瘤治療方法主要有三種:手術(shù)、放療和化療，但這三種方法均存在一定的局限性，這促使人們?nèi)ふ腋永硐氲闹委煼椒ā＝┠陙恚S著人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入了解，以及腫瘤免疫學(xué)、分子生物學(xué)及生物工程技術(shù)的發(fā)展，腫瘤生物治療(Biotherapy/Immunotherapy)迅速發(fā)展起來，成為腫瘤綜合治療中的一種新的治療模式。腫瘤生物治療可概括為:任何生物學(xué)物質(zhì)或生物制劑在腫瘤的治療性應(yīng)用;它主要通過調(diào)動機(jī)體的天然防衛(wèi)機(jī)制或給予天然（或基因

2、工程）產(chǎn)生的靶向性很強(qiáng)的物質(zhì)來取得抗腫瘤效應(yīng)。目前已經(jīng)開展的腫瘤生物治療技術(shù)和方法主要包括:腫瘤疫苗、細(xì)胞因子、基因治療、單克隆抗體、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用以及過繼性免疫治療等;其中使用機(jī)體免疫細(xì)胞對抗腫瘤的過繼性免疫治療發(fā)展較為成熟，在腫瘤生物治療中占有重要地位。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)作為目前已知的最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞(Antigen presenting cells，APCs)，處于維持和調(diào)

3、節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。越來越多的證據(jù)表明由DC激活的免疫應(yīng)答，在機(jī)體抵御惡性腫瘤中發(fā)揮著十分重要的作用;以DC為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫治療（也稱為DC疫苗），已成為腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)開展了多項(xiàng)以DC疫苗為主要腫瘤治療手段的臨床實(shí)驗(yàn);第一種被FDA批準(zhǔn)用于臨床的治療性疫苗，Provenge(sipuleucel-T)，已與2010年上市，并用于晚期前列腺癌患者的治療。機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答由成熟DC與微環(huán)境中的其他免疫

4、細(xì)胞所主導(dǎo)，其中初始T細(xì)胞（na(i)ve T cells）的分化方向?qū)鼓[瘤免疫應(yīng)答起到重要的調(diào)節(jié)作用。初始T細(xì)胞在DC的作用下發(fā)生極化，主要分化為兩類不同的輔助性T細(xì)胞(T helper cells,Th cells)，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。Thl細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)等;h2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和超敏反應(yīng)。選擇性激活Th1或Th2細(xì)胞是調(diào)節(jié)免

5、疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對機(jī)體的抗腫瘤免疫具有重要影響;DC與微環(huán)境中的其他因子決定了初始CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞分化。
　　 盡管在實(shí)驗(yàn)室制備的DC疫苗在臨床前實(shí)驗(yàn)特別是體外實(shí)驗(yàn)中取得了較好的效果，但是在臨床應(yīng)用中卻存在諸多問題，主要包括誘發(fā)的抗腫瘤免疫應(yīng)答較弱、個體差異大等。DC疫苗在體外和體內(nèi)特別是臨床治療應(yīng)用中抗腫瘤治療效果的顯著差異提示，體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境可能會影響甚至改變DC的性質(zhì)和功能。腫瘤微環(huán)境的主要特征包

6、括乏氧，低pH值和營養(yǎng)缺乏等。局部乏氧是實(shí)體瘤腫瘤微環(huán)境的重要特征，不僅對腫瘤細(xì)胞本身的生物學(xué)行為有重要影響，如對放化療抵抗、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等;而且會顯著影響腫瘤局部免疫細(xì)胞的性質(zhì)、功能和基因穩(wěn)定性等。
　　 在乏氧微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞的基因不穩(wěn)定性增高，容易發(fā)生DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)等DNA損傷。DNADSBs主要有兩種修復(fù)方式，同源重組(homologous recombinatio

7、n,HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。在乏氧條件下，HR和NHEJ這兩中主要的DNADSBs修復(fù)通路都會受到顯著抑制，需要其他的通路參與DSBs的修復(fù)。微同源序列介導(dǎo)的末端連接(microhomology-mediated end joining，MHEJ)是一種新近發(fā)現(xiàn)的DSBs修復(fù)方式;在乏氧環(huán)境下，由于主要DSBs修復(fù)通路受到抑制，其作為一種“后備”修復(fù)通路，活性可能會得到增

8、強(qiáng)。人單核來源的DC，在其分化和成熟過程中，伴隨著廣泛的基因表達(dá)變化，其中可能存在著DNA的斷裂和修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，MHEJ不僅與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，而且在免疫系統(tǒng)發(fā)育和B細(xì)胞分化中具有獨(dú)特而又重要的作用;但是MHEJ是否在DC特別是乏氧微環(huán)境下的DC分化和成熟過程中作為一種重要的參與機(jī)制，還未見相關(guān)報(bào)道，需要進(jìn)一步的研究。
　　 本課題研究了乏氧微環(huán)境下DC對Th細(xì)胞極化的影響，探討了其可能的機(jī)制，為改進(jìn)和提高DC疫苗治療腫瘤

9、的臨床效果提供了理論基礎(chǔ);并且建立了MHEJ這一DNADSBs修復(fù)方式的細(xì)胞基礎(chǔ)的報(bào)告系統(tǒng)，可用于研究MHEJ對乏氧DC功能的影響及其可能的參與機(jī)制。
　　 第一部分：乏氧DC誘導(dǎo)初始T細(xì)胞發(fā)生非典型的Th2極化
　　 目的:在乏氧微環(huán)境下誘導(dǎo)人單核細(xì)胞來源的DC，研究其對初始T細(xì)胞極化特別是細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響。
　　 方法:采用密度梯度離心法從健康人外周血中分離單個核細(xì)胞，然后用CD14磁珠陽性分選分離純化單

10、核細(xì)胞;單核細(xì)胞分別在常氧(21％O2、5％CO2)和乏氧（1％O2、5％CO2和94％N2混合氣體）條件下在含GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(500U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，在第5天未成熟DC(immatureDC，imDC)培養(yǎng)基中加入1ug/mlLPS，刺激DC成熟，在第7天收取成熟DC(matureDC，mDC)。密度梯度離心法分離健康志愿者外周血單個核細(xì)胞，然后用NaiveCD4+TCellIs

11、olationKitⅡ陰性分選分離純化NaiveCD4+T細(xì)胞。將分選的NaiveCD4+T細(xì)胞與在不同培養(yǎng)條件下（常氧、乏氧）誘導(dǎo)的成熟DC共培養(yǎng)，在第5天加入IL-2(50U/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)至第9天時加入PMA（100nM）和離子霉素（1μg/ml）;24小時后收集上清，用懸浮芯片技術(shù)檢測Th2細(xì)胞因子的表達(dá);同時用CD4磁珠分離共培養(yǎng)體系中的CD4+T細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用實(shí)時定量PCR檢測Th2極化相關(guān)調(diào)控因

12、子mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:在乏氧微環(huán)境下培養(yǎng)誘導(dǎo)的成熟DC與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過懸浮芯片檢測發(fā)現(xiàn)，IL-4這一Th2應(yīng)答的標(biāo)志性細(xì)胞因子的表達(dá)明顯升高（約為常氧對照組的2倍）;這說明乏氧DC誘導(dǎo)初始T細(xì)胞發(fā)生Th2優(yōu)勢應(yīng)答，與我們以前的研究中得到的結(jié)果相一致。但是另外兩個主要的Th2細(xì)胞因子，IL-5和IL-13，其表達(dá)卻顯著下降;分別下降了7倍和5倍，高于IL-4的升高倍數(shù)。同時，我們發(fā)現(xiàn)調(diào)控Th2細(xì)胞因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄

13、基因GATA3和c-Maf的表達(dá)，與常氧對照組相比較，也發(fā)生了顯著變化。調(diào)控IL-4表達(dá)的c-MafmRNA的表達(dá)顯著上調(diào)（＞25倍），而調(diào)控IL-5和IL-13表達(dá)的GATA3mRNA的表達(dá)則僅略微下調(diào)（下降了27％）。
　　 結(jié)論:乏氧條件下培養(yǎng)的DC使得初始T細(xì)胞發(fā)生非典型的Th2極化，IL-4的表達(dá)升高，而IL-5和IL-13的表達(dá)則降低;這些改變可能與調(diào)控Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)改變有關(guān)。
　　 第二部分：

14、KIF2A/MT1-MMP/CD44參與乏氧DC誘導(dǎo)的非典型Th2極化
　　 目的:研究乏氧DC誘導(dǎo)的非典型Th2極化的可能參與分子與調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.采用基因芯片技術(shù)檢測并比較常氧和乏氧條件下DC的基因表達(dá)譜，尋找感興趣的可能與DC引發(fā)非典型Th2應(yīng)答相關(guān)的分子;并用實(shí)時定量PCR驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果;
　　 2.根據(jù)芯片結(jié)果，選取CD44這一分子作為研究對象。采用流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸

15、附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)進(jìn)一步檢測CD44在DC表面和上清中的表達(dá);
　　 3.在未成熟DC培養(yǎng)基中加入CD44結(jié)合性抗體(J173mAb)，同時加入LPS刺激DC成熟;48小時后，收集成熟DC與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)，按第一部分所述方法進(jìn)行Th細(xì)胞極化試驗(yàn)。收集上清，采用懸浮芯片技術(shù)檢測Th2細(xì)胞因子的表達(dá);同時分離CD4+T細(xì)胞，提取RNA，用實(shí)時定量PCR檢測GATA3

16、和c-Maf的表達(dá);
　　 4.根據(jù)基因芯片檢測的結(jié)果，調(diào)取參與調(diào)控CD44表達(dá)的基因膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type 1 metalloprotease，MT1-MMP)的表達(dá)，用實(shí)時定量PCR驗(yàn)證其mRNA水平的表達(dá)，并采用免疫熒光和western blot分別定位和檢測MT1-MMP蛋白水平的表達(dá);
　　 5.在DC培養(yǎng)基中加入MT1-MMP阻斷抗體，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測MT1-MM

17、P對CD44在DC表面和上清中表達(dá)的影響;
　　 6.在基因芯片結(jié)果中，調(diào)取與MT1-MMP表達(dá)調(diào)控可能相關(guān)的驅(qū)動蛋白超家族（kinesin superfamily protein，KIF）基因的表達(dá)情況;用實(shí)時定量PCR和western blot分別進(jìn)一步確認(rèn)相關(guān)基因的表達(dá)改變;
　　 7.用特異性siRNA敲減KIF2A這一KIF家族差異表達(dá)基因在DC的表達(dá)，并用實(shí)時定量PCR、western blot以及免疫熒光技

18、術(shù)檢測其對MT1-MMP表達(dá)的影響;用免疫共沉淀法檢測KIF2A與MT1-MMP蛋白之間的相互作用;同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測KIF2AsiRNA是否能直接影響CD44在DC的表達(dá);
　　 8.采用特異性siRNA敲減的方法，探討KIF2A在乏氧DC的表達(dá)是否受缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的調(diào)控。
　　 結(jié)果:
　　 1.基因芯片結(jié)果表明，與常氧成熟DC相

19、比較，CD44在乏氧成熟DC的表達(dá)顯著增高;實(shí)時定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果;
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，乏氧成熟DC表面的CD44表達(dá)上調(diào);而ELISA結(jié)果表明，DC上清中可溶性CD44的表達(dá)降低;
　　 3.加入CD44結(jié)合性抗體后，乏氧DC能進(jìn)一步促進(jìn)初始T細(xì)胞向非典型Th2極化方向分化，表現(xiàn)為進(jìn)一步的IL-4分泌水平升高和IL-5和IL-13的表達(dá)降低;
　　 4.比較常氧和乏氧DC的基因芯片檢測結(jié)

20、果發(fā)現(xiàn)，乏氧成熟DCMT1-MMP的表達(dá)下調(diào);實(shí)時定量PCR和westernblot進(jìn)一步證實(shí)了MT1-MMP在mRNA和蛋白水平的下調(diào)表達(dá);免疫熒光檢測顯示MT1-MMP主要定位于DC的胞漿，并且在乏氧DC的表達(dá)弱于常氧DC;
　　 5.加入MT1-MMP阻斷性抗體后，DC表面的CD44表達(dá)升高，而上清中可溶性CD44的表達(dá)下降;
　　 6.從基因芯片結(jié)果中調(diào)取KIF家族主要成員在DC的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)乏氧能下調(diào)KIF2

21、A在成熟DC的表達(dá);這一結(jié)果通過實(shí)時定量PCR和western blot得到了進(jìn)一步證實(shí);
　　 7.KIF2AsiRNA能敲減KIF2A在DC的表達(dá)（mRNA和蛋白水平），同時其能使MT1-MMP在DC的表達(dá)顯著下調(diào);通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KIF2A和MT1-MMP蛋白之間存在相互作用;KIF2AsiRNA也能直接上調(diào)CD44在DC的表達(dá);
　　 8.乏氧條件下培養(yǎng)的DC，在LPS刺激成熟過程中，HIF-1α的表達(dá)顯

22、著增高;在乏氧條件下，采用特異性siRNA抑制HIF-1α在成熟DC的表達(dá)時，KIF2A的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá)的CD44能促進(jìn)乏氧DC引發(fā)初始T細(xì)胞發(fā)生非典型的Th2極化;
　　 2.MT1-MMP可促使CD44從細(xì)胞表面脫落;乏氧條件下，MT1-MMP在DC的表達(dá)下調(diào)，CD44從DC表面脫落減少，從而使得DC表面CD44表達(dá)增高，而上清中可溶性CD44減少;
　　 3

23、.在乏氧條件下，KIF家族中的KIF2A在成熟DC的表達(dá)降低;KIF2AsiRNA能抑制MT1-MMP在DC的表達(dá)，同時其也能直接上調(diào)CD44在DC表面的表達(dá);
　　 4.乏氧條件下KIF2A在DC的表達(dá)受HIF-1α所調(diào)控。
　　 第三部分：乏氧DC功能研究中MHEJ報(bào)告系統(tǒng)的建立
　　 目的:建立MHEJ這一DNA雙鏈斷裂修復(fù)方式的細(xì)胞基礎(chǔ)的檢測報(bào)告系統(tǒng)，探討系統(tǒng)本身的可能影響因素，篩選可用于乏氧DC功能研究

24、的MHEJ報(bào)告系統(tǒng)。
　　 方法:
　　 1.將嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(puromycin acetyltransferase，Pac;可使細(xì)胞具有嘌呤霉素抗性)基因擴(kuò)增純化后，酶切，然后在該位點(diǎn)插入一含有I-SceI(TAGGGATAACAGGGTAAT)和AscI(GGCGCGCC)識別位點(diǎn)的18-bp片段，該插入片段的兩端分別具有一5-bp或10-bp長的重復(fù)序列;在研究插入的長片段對MHEJ影響時，將約1kb長的DN

25、A片段插入含有10-bp重復(fù)序列的AscI位點(diǎn)。將這一含有功能失活的Pac基因和重復(fù)序列的DNA片段，插入到pIREShyg3質(zhì)粒中;該質(zhì)粒同時含有潮霉素B(hygromycin B)基因，能使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有hygromycinB抗性;
　　 2.將含有失活Pac基因的pIREShyg3質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)入人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080中;電轉(zhuǎn)2天后，加入hygromycinB篩選;約14天后，挑選成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒并整合到細(xì)胞基

26、因組中的具有hygromycinB抗性的克?。℉T1080MHEJ細(xì)胞株）。用Southern blotting檢測整合到篩選的HT1080細(xì)胞克隆中的報(bào)告基因拷貝數(shù);
　　 3.將挑選出的含有MHEJ報(bào)告基因的HT1080細(xì)胞分別種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，1天后加入puromycin;同時設(shè)不加puromycin的細(xì)胞組，用于計(jì)算克隆形成效率。puromycin選擇9-12天后，將形成的克隆用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù);并計(jì)算自發(fā)性MHEJ的頻

27、率;
　　 4.用表達(dá)I-SceI的pCMV(3xNLS)I-SceI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染只含有1個MHEJ報(bào)告基因的HT1080細(xì)胞，24小時后將細(xì)胞種于培養(yǎng)皿中;用上述puromycin選擇法計(jì)算I-SceI導(dǎo)致的位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂中MHEJ的頻率。
　　 結(jié)果:
　　 1.hygromycinB篩選14天后，得到了數(shù)個含有MHEJ報(bào)告基因的HT1080克隆;其中含有5-bp重復(fù)序列的克隆有7個，含有10-bp重復(fù)

28、序列的克隆有15個，以及12個含有10-bp重復(fù)序列及1kb插入片段的克隆;Southern blotting結(jié)果表明，篩選出的HT1080克隆基因組中被整合進(jìn)入了1個或多個(2-5個)拷貝的MHEJ報(bào)告基因;
　　 2.在自發(fā)性MHEJ檢測中，在含有5-bp和10-bp重復(fù)序列的HT1080MHEJ細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了發(fā)生自發(fā)性MHEJ的細(xì)胞集落，這些細(xì)胞具有puromycin抗性。在7個含有5-bp重復(fù)序列的HT1080MHEJ細(xì)

29、胞株中，僅有1個細(xì)胞株篩選出具有puromycin抗性的細(xì)胞集落(1/7)，而在15個含有10-bp重復(fù)序列的HT1080MHEJ細(xì)胞株中，有7個細(xì)胞株中檢測到自發(fā)性MHEJ的發(fā)生(7/15)。含有5-bp重復(fù)序列的細(xì)胞株平均整合的MHEJ報(bào)告基因拷貝數(shù)為2.7，含有10-bp重復(fù)序列的細(xì)胞株整合的平均拷貝數(shù)為1.9。唯一一個發(fā)生MHEJ的5-bp細(xì)胞株中整合了5個拷貝的報(bào)告基因，而在7個發(fā)生MHEJ的10-bp細(xì)胞株中也有6個是具有多

30、個拷貝的MHEJ報(bào)告基因的細(xì)胞株;
　　 3.含有5-bp重復(fù)序列的HT1080MHEJ細(xì)胞的自發(fā)性MHEJ頻率平均值為3×10-8，含有10-bp重復(fù)序列HT1080MHEJ細(xì)胞的自發(fā)性MHEJ頻率平均值為20×10-8，而同時含有10-bp重復(fù)序列和1kb插入片段的HT1080細(xì)胞未篩選出發(fā)生MHEJ的細(xì)胞集落;
　　 4.I-SceI轉(zhuǎn)染后，含有5-bp重復(fù)序列的HT1080細(xì)胞發(fā)生MHEJ的頻率平均值為1.022

31、×10-3，含有10-bp重復(fù)序列的HT1080細(xì)胞發(fā)生MHEJ的頻率平均值為6.444×10-3，而含有10-bp重復(fù)序列和1kb插入片段的HT1080細(xì)胞的MHEJ發(fā)生頻率最低，為2.200×10-6。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立了細(xì)胞基礎(chǔ)的MHEJ檢測報(bào)告系統(tǒng);
　　 2.含有10-bp重復(fù)序列的HT1080克隆自發(fā)性MHEJ的發(fā)生頻率高于含有5-bp重復(fù)序列的克隆，而中間插入1kb片段的10-bp重

32、復(fù)序列克隆未檢測到自發(fā)性MHEJ的發(fā)生。這說明，重復(fù)序列或微同源序列的大小會影響MHEJ修復(fù)的效率，長的重復(fù)序列可能能夠更為高效的介導(dǎo)MHEJ的發(fā)生;在含有同樣大小的重復(fù)序列時，整合的報(bào)告基因拷貝數(shù)越多，發(fā)生MHEJ的幾率越高;而且兩個重復(fù)序列的接近程度越大，MHEJ越容易發(fā)生;
　　 3.I-SceI引發(fā)的位點(diǎn)特異性DNA雙鏈斷裂MHEJ的發(fā)生頻率高于自發(fā)性MHEJ的發(fā)生頻率;與其他長度的重復(fù)序列相比較，10-bp重復(fù)序列能夠