外源性TGF-β3對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)源性TGF-β3表達(dá)及其增殖的影響.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor，TGF-β）是一種多功能的多肽類細(xì)胞因子超家族，幾乎體內(nèi)所有細(xì)胞都能分泌TGF-β并存在其受體，在細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中起重要作用。TGF-βl是最重要的致纖維化因子，而TGF-β3則有拮抗TGF-βl的作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β3在肝臟中具有抗肝纖維化功能。為了促進(jìn)機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性TGF-β3的大量表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用外源性重組細(xì)胞因子TGF-β3干預(yù)大鼠肝星狀細(xì)胞（Hep

2、atic stellate cell，HSC），通過(guò)檢測(cè)HSC中TGF-β3mRNA、蛋白的表達(dá)水平及HSC的增殖，探討外源性TGF-β3對(duì)HSC分泌內(nèi)源性TGF-β3及HSC增殖的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)HSC，加入外源性TGF-β3（10ng/ml）培養(yǎng)的細(xì)胞為T(mén)GF-β3組，未加入外源性TGF-β3培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，（1）分別在1h、2h、4h、12h和24h收集細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)源性TGF-β3

3、mRNA表達(dá)；（2）分別在0h、1h、6h和12h收集細(xì)胞，應(yīng)用western-blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGF-β3蛋白的表達(dá)；（3）分別在0h、2h、4h、8h、14h和24h收集細(xì)胞，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外總TGF-β3蛋白的表達(dá)；加入外源性TGF-β3培養(yǎng)HSC 2h，然后換用無(wú)TGF-β3的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至2.25h、2.5h、3h、4h、6h、10h和14h收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞外內(nèi)源性TGF-β

4、3蛋白的表達(dá)。（4）外源性TGF-β3對(duì)HSC增殖的影響：將HSC接種于96孔板，培養(yǎng)6h后，分為A、B兩組，A組用不同濃度的外源性TGF-β3干預(yù)HSC，24h后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，B組用5ng/ml外源性TGF-β3干預(yù)HSC，在24h和48h時(shí)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；（5）細(xì)胞形態(tài)分析：倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組和外源性TGF-β3干預(yù)組的HSC大體形態(tài)。
　　 結(jié)果：（1）加入外源性TGF-β3干預(yù)HSC后，細(xì)胞

5、內(nèi)TGF-β3mRNA表達(dá)水平明顯增高，于2h達(dá)峰值（3.756±0.667：1.207±0.129），為對(duì)照組的3.11倍（P<0.05），隨后緩慢降低，維持在1.56倍水平達(dá)10h之久，24h時(shí)(1.375±0.131：1.066±0.085)表達(dá)水平仍為對(duì)照組的1.30倍（P＜0.05）；（2）不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)TGF-β3表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P>0.05）；（3）細(xì)胞外總TGF-β3含量明顯增加，于4h時(shí)達(dá)高峰（18.931±2.

6、904：10.026±0.022ng/ml），約為干預(yù)量的1.89倍，隨后開(kāi)始下降；內(nèi)源性TGF-β3于干預(yù)后3h達(dá)高峰(0.835±0.027：0.026±0.022ng/ml)，為對(duì)照組的32.36倍，之后開(kāi)始逐漸降低，直至維持一個(gè)弱增長(zhǎng)的表達(dá)狀態(tài)（P<0.05）。（4）低濃度的外源性TGF-β3（0.001-0.08ng/ml）不影響HSC的增殖，從0.32ng/ml開(kāi)始，外源性TGF-β3可促進(jìn)HSC的增殖，HSC的增殖與外源性