濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者高表達(dá)抗可溶性肝抗原抗體的影響.pdf

1、背景：
　　肝衰竭是臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群，病情嚴(yán)重、并發(fā)癥多、治療困難，在我國病死率高達(dá)60～80％。我國肝衰竭的病因主要為乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，目前臨床表現(xiàn)主要以慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)為主。在我國急性肝衰竭(acute liver failure，AHF)租亞急性肝衰竭呈現(xiàn)減少趨勢，而慢加急性肝衰竭和慢性肝衰竭呈增加趨

2、勢。
　　HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure，H-A)的發(fā)病過程中，機(jī)體針對HBV的特異性免疫和非特異性免疫狀態(tài)，與其他慢性HBV感染狀態(tài)相比，發(fā)生了很大的變化。其中機(jī)體體液免疫方面也發(fā)生了很多的變化，如在H-A患者體內(nèi)其表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)水平較慢性乙型肝炎（chronic hepat

3、itis B，CHB）低，并且發(fā)生了HBeAg/抗HBe的血清學(xué)轉(zhuǎn)換，甚至在很多患者體內(nèi)會出現(xiàn)自身抗體譜轉(zhuǎn)陽的情況。
　　研究中發(fā)現(xiàn)在慢性HBV感染過程中出現(xiàn)了大量自身抗體的轉(zhuǎn)陽，包括抗核抗體、抗線粒體抗體、抗平滑肌抗體等。其中抗可溶性肝抗原抗體(anti-soluble liver antigen antibody，anti-SLA/抗SLA)是肝抗原自身抗體的類型之一，有研究表明抗SLA在CHB、代償性肝硬化、非代償性肝硬化、

4、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、急性肝衰竭(acute liver failure，AHF)中的陽性率分別為2.2％、3.5％、1.7％、2.6％、21.9％。但是，目前還沒有關(guān)于抗SLA在H-A中的研究，而且為什么肝衰竭的患者中自身抗體表達(dá)上調(diào)，其機(jī)理也不清楚。
　　抗體的產(chǎn)生是精細(xì)而復(fù)雜的過程。濾泡輔助性T細(xì)胞(Follicular T helper cells，Tfh細(xì)胞)輔助B細(xì)胞分化

5、為漿細(xì)胞、產(chǎn)生抗體、及抗體類別轉(zhuǎn)換。二者相互作用，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。研究顯示在自身免疫疾病中，Tfh細(xì)胞及其亞群頻數(shù)發(fā)生變化，同時(shí)B細(xì)胞處于功能失調(diào)狀態(tài)。在生發(fā)中心(Germinal Center，GC)的濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Follicular T regulatory cells，Tfr細(xì)胞），主要參與生發(fā)中心的反應(yīng)，抑制Tfh細(xì)胞和B細(xì)胞，避免自身抗體的產(chǎn)生，與自身免疫性疾病相關(guān)。因此本文旨在研究Tfr細(xì)胞對H-A患者血

6、漿抗SLA異常表達(dá)的影響。
　　目的：
　　本研究是以HBV感染自然史的橫向人群為研究對象，主要研究H-A患者表達(dá)自身抗體SLA的程度，以及高表達(dá)抗SLA與Tfr細(xì)胞頻數(shù)和功能的關(guān)系。
　　方法：
　　1.研究對象
　　26例H-A為本院及廣州市第八人民醫(yī)院2015年3月至2016年2月的門診或住院患者，其中男21例，女5例。所有病例的診斷符合2012年《肝衰竭診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另對照組中包括16例CH

7、B患者，男15例，女1例;代償性肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者17例，男15例，女2例;14例在院進(jìn)行健康體檢(health control，HC)各型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物陰性及肝功能正常的人群作為健康對照組。CHB及LC的診斷均符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　入選的研究對象均排除以下情況:合并感染甲型肝炎病毒(hepatitis a virus，HAV)，丙型肝炎病毒(hepatitis

8、c virus，HCV)，丁型肝炎病毒(hepatitis d virus，HDV)，戊型肝炎病毒（hepatitis e virus，HEV）或人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV);合并糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、自身免疫性肝病等自身免疫性疾病;合并惡性腫瘤及其他嚴(yán)重代謝性疾病。所有研究對象均簽署知情同意書。
　　1.血漿中抗SLA水平
　　采用ELISA方法檢測HC、CHB、L

9、C、H-A組患者血漿中的抗SLA的OD值。并且將該值與肝功能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.外周血Tfr細(xì)胞頻數(shù)及相關(guān)表型分子表達(dá)情況
　　利用流式細(xì)胞染色技術(shù)，檢測慢性HBV感染者外周血Tfr細(xì)胞頻數(shù)及表型分子GITR、CTLA-4的表達(dá)情況。比較各組間Tfr細(xì)胞頻數(shù)及表型差異。
　　3.血漿中相關(guān)細(xì)胞因子水平
　　采用流式多因子檢測(CBA)方法，檢測各組血漿中的相關(guān)細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-

10、10、GranzymeA、GranzymeB）水平。比較各組及H-A組內(nèi)的細(xì)胞因子濃度大小及平均熒光密度(MFI)。同時(shí)將HBV感染者血漿中相關(guān)細(xì)胞因子及抗SLA的OD值與Tfr細(xì)胞頻數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　4.外周血Tfr細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平
　　利用流式細(xì)胞內(nèi)因子染色(ICS)技術(shù)，檢測慢性HBV感染者外周血Tfr細(xì)胞在CD3和CD28刺激情況下，分泌細(xì)胞因子(GranzymeA、GranzymeB、IL-10、IL-2

11、1和TNF-α及IFN-γ)水平。
　　5.統(tǒng)計(jì)分析
　　計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，兩組間計(jì)量資料間采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不滿足方差分析條件采用Mann-Whitney U test及Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism5.0及SPSS20.0進(jìn)行處理及作圖。所有的統(tǒng)計(jì)分析基于雙側(cè)假設(shè)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　

12、　1.慢性HBV感染組血漿中的抗SLA水平均顯著高于HC組(P＜0.001)，而H-A組抗SLA的OD值顯著高于CHB(P＜0.001)、LC組(P＜0.001);在HBV感染者中，抗SLA的OD值大小與ALT(R=0.260，P=0.046)及TBIL(R=0.646，P＜0.001)呈正相關(guān)，與HBV-DNA無明顯相關(guān)(R=-0.069，P=0.598)。在H-A組，抗SLA的OD值大小與總膽酸(TBA)呈正相關(guān)(R=0.478，P

13、=0.024)，與凝血酶原活動度(PTA)、ALT、AST、DBIL、TBIL無顯著相關(guān)性。
　　2.慢性HBV感染者外周血CD4+T細(xì)胞頻數(shù)無顯著性差異，H-A組中的Tfr細(xì)胞頻數(shù)明顯低于HC(P＜0.001)、CHB(P＜0.001)、LC(P＜0.001)，H-A組中的Tfh細(xì)胞頻數(shù)明顯低于HC(P＜0.001)、CHB(P＜0.010)、LC(P＜0.001)，且在H-A組中的Tfr/Tfh明顯低于HC(P＜0.001)、

14、CHB(P＜0.001)、LC(P＜0.001)。H-A患者外周血中Tfr細(xì)胞的兩種主要功能表型（GITR和CTLA-4），CTLA-4的表達(dá)明顯高于GITR(P＜0.050)，但是HBV感染者外周血中Tfr細(xì)胞表達(dá)兩種表型無顯著差異。
　　3.H-A患者血漿中的2種細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）濃度明顯高于CHB(P＜0.050，P＜0.001)，GranzymeA明顯高于HC(P＜0.010)。而IL-10濃度明顯高于HC

15、(P＜0.001)、CHB(P＜0.050)、LC(P＜0.001)。而GranzymeB的水平?jīng)]有顯著差異。在H-A組內(nèi)的5種細(xì)胞因子濃度無顯著差異。H-A血漿中分泌的4種細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-10、GranzymeA）MFI明顯高于HC、CHB、或者LC，并且H-A組內(nèi)血漿中5種細(xì)胞因子間的MFI均存在顯著差異。
　　4.慢性HBV感染者中Tfr細(xì)胞頻數(shù)與血漿中IL-10水平呈負(fù)相關(guān)(R=-0.390，P=0

16、.030)，同時(shí)與血漿中分泌的抗SLA呈負(fù)相關(guān)(R=-0.450，P＜0.010)，而與GranzymeA及GranzymeB無顯著相關(guān)。
　　5.慢性HBV感染者PBMC經(jīng)CD3/CD28刺激后，Tfr細(xì)胞相關(guān)的6種細(xì)胞因子（GranzymeA、GranzymeB、IL-10、IL-21、TNF-α及IFN-γ）無顯著差異。H-A組內(nèi)CD3/CD28刺激后，Tfr細(xì)胞相關(guān)的6種細(xì)胞因子(GranzymeA、GranzymeB、I