隱丹參酮非臨床藥代動力學研究.pdf

1、本研究的目的是系統(tǒng)地研究CTS在大鼠與Beagle犬體內的吸收、分布、代謝、排泄過程，闡明CTS及其代謝物體內藥動學特征，為藥物的藥效、毒理評價以及臨床新藥報批提供資料，為其它丹參酮類化合物的藥代動力學研究提供參考和新思路。 本研究的主要內容包括以下幾個部分： 一、建立檢測生物樣品中CTS、TS ⅡA及結合型CTS、TS ⅡA的LC/MS/MS分析方法目的建立檢測生物樣品中CTS、代謝物丹參酮ⅡA(tanshinone

2、ⅡA，TSⅡA)以及結合型CTS、TS ⅡA的方法，用于藥動學的分析研究。 結論：本部分建立并確證了檢測生物樣品中CTS、代謝物TS ⅡA以及結合型CTS、TS ⅡA的靈敏度高、特異性強、快速可靠、線性良好的方法，該分析方法的樣品處理及檢測過程較已報道的方法簡單、快速，可滿足CTS藥代動力學研究的要求。 二、CTS的血藥濃度-時間曲線及吸收目的研究大鼠與Beagle犬灌胃和靜脈注射不同劑量CTS后原型與代謝物的藥代動力學

3、及生物利用度。 方法：采用高效液相色譜．串聯(lián)質譜(LC/MS/MS)方法測定血漿中CTS與TS ⅡA的濃度，用非房室模型計算其藥代動力學參數，用線性相關、方差分析等方法對藥動學參數進行了統(tǒng)計分析。 結果：大鼠口服CTS 30～180 mg/Kg劑量范圍CTS的AUC0-τ與AUC0-∞均隨給藥劑量的增加而增加，分別將AUC與劑量作線性回歸，r值為0.99～1.00，各劑量組t1/2等參數經組間方差分析無統(tǒng)計學差異，CTS

4、的消除半衰期為4.2～5.4 h，口服生物利用度為6.7％±2.1％，代謝物TS ⅡA、葡萄糖醛酸結合型CTS(CTSⅡ)、葡萄糖醛酸結合型TS ⅡA(TS ⅡAⅡ)的消除半衰期分別為4.1～5.4 h、4.2～5.5 h及5.9～8.8 h，以摩爾濃度計算大鼠口服30、60、180 mg/Kg CTS后原型藥與各代謝物在體內水平之比分別為(AUCCTS：AUCTS：AUCCTS-Ⅱ：AUCTSⅡA-Ⅱ)1.0：0.7：1.4：1.5、

5、1.0：0.2：3.7：2.5與1.0：0.1：3.3：0.8；Beagle犬口服CTS 17.8～160.2mg/kg劑量范圍CTS的AUC0-t與AUC0-∞均隨給藥劑量的增加而增加，分別將AUC與劑量作線性回歸r值為0.8～0.84，各劑量組t1/2等參數經組間方差分析無統(tǒng)計學差異，CTS的消除半衰期為6.1～7.8 h，口服生物利用度為11.3％±3.7％，代謝物TS IIA、CTSⅡ、TS IIAⅡ的消除半衰期分別為5.2～5

6、.5 h、7.5～8.3 h及6.2～6.8h，以摩爾濃度計算Beagle犬口服17.8、53.4、160.2 mg/Kg CTS后原型藥與各代謝物在體內水平之比分別為(AUCCTS：AUCTS：AUCCTS-Ⅱ：AUCTSⅡA-Ⅱ)1.0：0.3：2.0：2.0、1.0：0.5：0.3：0.2與1.0：0.4：1.0：0.6。Beagle犬多次給藥后體內血藥濃度未能達穩(wěn)態(tài)，但CTS與Ⅰ相、Ⅱ相代謝物在體內的水平均較單次給藥增加。結論通

7、過劑型改造后，CTS的口服生物利用度較以往研究已有很大提高。大鼠口服CTS 30～180 mg/Kg劑量范圍CTS在體內的藥動學過程符合線性。Beagle犬口服CTS 17.8～160.2 mg/kg范圍CTS在體內的藥動學過程基本符合線性特征。多次給藥或大劑量給藥后CTS不會在體內發(fā)生累積，但可能會因為生物利用度的增加導致原型與代謝物濃度的增加。 CTS脂溶性高的理化特性并不是造成藥物口服后血藥濃度低的唯一原因，CTS在組織的

8、廣泛分布、廣泛的Ⅰ、Ⅱ相代謝以及P-gp糖蛋白對CTS的外排都對口服CTS在體內的血藥濃度產生影響，CTS的低口服生物利用度是上述因素綜合作用的結果。但尚需組織分布實驗、代謝實驗進一步證明。 三、CTS在大鼠體內的分布研究目的研究口服和靜脈注射給藥后CTS與TS ⅡA在大鼠各組織中的分布特點及組織中藥物濃度隨時間的變化規(guī)律?！　》椒ǎ捍笫髥未慰诜蜢o脈注射給予CTS制劑60 mg/Kg后于0.5、1.5、3.0、20.0、48

9、、72 h處死動物，取各組織器官，制成0.5 g/mL勻漿，取勻漿處理，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜(LC/MS/MS)方法測定各組織勻漿中CTS與代謝物TS ⅡA的濃度，梯形法計算CTS與TS ⅡA在組織與血中的AUC0-t與Kp值(組織/血漿中藥物濃度比，Kp=[AUC0-t(組織)/AUC0-t(血漿)])。 結果：給藥后在組織中CTS與TS ⅡA的濃度遠遠高于血漿濃度?？诜o藥各組織的CTS與TS ⅡA的Kp值分別為為0.

10、3～254.7與20.5～11143.0；靜脈給藥各組織的CTS與TS ⅡA的Kp值分別為為0.2～2109.8與20.5～303.3。靜脈給藥后大部分組織CTS與TS ⅡA組織藥物濃度．時間曲線在給藥后3 h出現“第二峰”。原型與代謝物濃度在不同給藥途徑、不同臟器不同：口服給藥時以CTS與TS ⅡA在胃、肺、小腸和肝臟最高，靜注給藥時以肺部、脂肪、心、肝最高，靜脈給藥后72 h肺中仍能檢測到原型。CTS在腦組織中藥物濃度較低，但仍可達

11、到一定濃度。 結論：給藥后原型與代謝物均能在大鼠體內能迅速、廣泛分布，藥物在各組織中的分布屬灌流限制性，分布的速度與程度受器官灌流速度、藥物在該組織的Kp值、藥物與組織的親和力等因素影響。CTS在腦中能達到一定的濃度，為藥物的藥效實驗結果提供藥動學支持。口服與靜脈給藥途徑下CTS與TS ⅡA在胃腸分布結果表現出顯著差異，提示口服給藥后胃腸對藥物及代謝物有“吸附”作用。靜脈給藥后大部分組織CTS與TS ⅡA組織藥物濃度．時間曲線出

12、現雙峰現象很可能與EHC有關，從另一方面證明了EHC對體內藥物水平的影響。關于CTS及代謝物TS ⅡA肺蓄積的原因和機制以及EHC是否是造成靜脈給藥后組織藥物-時間曲線出現雙峰的原因需進一步的實驗研究。 四、CTS對大鼠肝代謝酶的影響以及在大鼠體內的代謝　　目的：　　1.大鼠口服CTS制劑后藥物對大鼠肝微粒體CYP酶各亞型的影響。 2.研究CTS在體內的代謝產物與代謝途徑。 方法：大鼠連續(xù)10日口服20～54

13、0 mg/Kg CTS制劑后，處死動物并取肝臟制備肝微粒體，分別用"Cocktail”體外孵育法、Western-blotting以及RT-PCR考察CTS對CYP酶各亞型酶活性、蛋白以及基因表達的變化。 采用LC/MS/MS技術，通過對體外肝微粒體孵育，體外含氨肝微粒體體系孵育，健康大鼠口服CTS制劑后血、組織、膽汁、尿、糞便樣品以及高血氨模型大鼠口服CTS后血、組織、尿、糞便樣品分析，考察CTS在體內的代謝產物與代謝途徑。

14、 結果：大鼠連續(xù)10日口服不同劑量CTS：20、60、180以及540 mg/Kg/day劑量組CYPlA2探針代謝物的量分別比陰性對照組提高60％、200％、220％和430％，CYP1A2的蛋白表達分別比陰性對照組提高130％、280％、210％和320％，CYP1A2的基因表達分別比對照組提高10％、30％、130％和150％。 結論：口服CTS后藥物能顯著誘導大鼠肝微粒體CYP1A2的基因和蛋白表達以及活性，而且呈

15、現劑量依賴性。提示經CYP1A2代謝的藥物在臨床上與CTS合用時，有可能發(fā)生藥物相互作用。 CTS在大鼠體內可進行廣泛的Ⅰ相代謝與Ⅱ相代謝，與文獻報道一致；其中CTS與氨結合代謝產物為首次報道，這與藥效學實驗顯示CTS可以清除體內血/腦氨結果相符，為CTS去除體內氨的作用機理提供藥動學依據。 五、CTS在大鼠體內的排泄目的研究CTS及其Ⅰ、Ⅱ相代謝物在大鼠體內的排泄。 方法大鼠單次口服CTS制劑60 mg/Kg后

16、收集尿液、膽汁和糞便樣品，采用高效液相色譜．串聯(lián)質譜(LC/MS/MS)方法測定樣品中非結合型與總CTS和TS ⅡA的濃度，計算CTS及其Ⅰ、Ⅱ相代謝物的累積排泄量和累積排泄百分率。 結果口服給藥后CTS和分別代謝成TS ⅡA、CTSⅡ、TS ⅡAⅡ的CTS經尿排泄累積百分率為1.2％(×10-3)、16.3％(×10-3)、2.3％(×10-3)、15.8％(×10-3)，經膽汁排泄為0.7％、0.4％、0.9％、0.3％，經

17、糞排泄為8.0％、4.8％、1.4％、0.8％，經尿、糞、膽汁排泄的累積百分率原型藥物約為15％。 結論：原型藥與代謝物自尿的排泄非常有限，而糞和膽汁是CTS及其代謝物的主要排泄途徑。CTS的排泄質量不守衡，推測廣泛的組織分布與代謝是造成這種現象的主要原因。 綜上所述，本研究在建立了快速、靈敏、可靠的LC/MS/MS分析方法的基礎上，對CTS及其Ⅰ、Ⅱ相代謝物在體內的吸收、分布、代謝、排泄過程進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現了CTS