消瘀化痰飲對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織UCP2表達的影響.pdf

1、目的：消瘀化痰飲(由丹參、郁金、澤瀉、制半夏、柴胡、決明子、生黃芪、炒白術(shù)等藥物組成)具有消瘀化痰、疏肝健脾功效，為導師經(jīng)臨床觀察篩選的效方，對非酒精性脂肪肝(NAFLD)具有較好的治療效果，為了進一步探討其作用機理，參照相關(guān)文獻運用高脂飲食復制NAFLD大鼠模型，同時施加藥物干預(yù)，觀察了其對NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝、肝功能的影響，探討了其促進脂質(zhì)代謝、保護肝功能的作用機制；運用免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法觀察了其對實

2、驗大鼠肝組織解偶聯(lián)蛋白2(UCP2)表達的影響，探討了其抑制UCP2過度表達的作用機制；并運用光鏡和電鏡觀察了本方對肝組織形態(tài)學的影響。 方法 第一部分消瘀化痰飲對NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝和肝組織形態(tài)學的影響選用SD大鼠50只，體重160～180g，雄性。大鼠自由飲水進食，飼養(yǎng)于18℃～22℃明暗各12小時的清潔級動物實驗室內(nèi)。正常喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組：正常對照組(簡稱正常組，normal control group，

3、N)、模型對照組(簡稱模型組，model group，M)、消瘀化痰飲高劑量組(簡稱高劑量組，high-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yin group，H)、消瘀化痰飲低劑量組(簡稱低劑量組，low-dose Xiao-Yu-Hua-Tan-Yingroup，L)、陽性藥(東寶甘泰)對照組(簡稱對照組，Dong-Bao-Gan-Tai control group，D)。除正常組喂飼普通飼料外，其余各組均喂飼高脂飼料。同時，

4、各用藥組灌服治療藥或?qū)φ账?，正常組與模型組灌服等量生理鹽水，每天上午灌胃1次，每次用藥體積均按1ml/100g計算，持續(xù)灌胃8周。9周末，于最后1次給藥后禁食12h麻醉狀態(tài)下股動脈取血，將血樣低溫離心，分離血清，密封，-20℃冷貯備用。于肝臟最大葉距邊緣0.5cm處取0.1 ×0.1×0.1cm3肝組織浸泡于4％戊二醛中固定，以備電鏡觀察。另取少許肝組織液氮冷凍以備肝勻漿檢測TG、Tc的含量，然后取相同部位肝組織0.5×0.5×0.5c

5、m3置于4％多聚甲醛液中固定，HE染色，以備光鏡觀察。第二部分消瘀化痰飲對NAFLD大鼠肝組織UCP2表達的影響實驗動物分組、用藥情況同前。連續(xù)喂養(yǎng)9周，確定脂肪肝形成后，于最后1次給藥禁食12h后麻醉動物，剖取肝臟，在肝臟最大葉距邊緣0.5cm處取適量肝組織置于液氮中冷凍，以備運用RT-PCR法觀察肝組織UCP2mRNA的表達變化；再取相同部位0.5cm×0.5cm×0.5cm3大小的肝組織于4％多聚甲醛中固定，以備運用免疫組化法觀察

6、肝組織UCP2的表達變化；另取相同部位適量肝組織，制作肝組織勻漿測定ATP的含量。 結(jié)果： 第一部分消瘀化痰飲對NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝和肝組織形態(tài)學的影響1 消瘀化痰飲對NAFLD大鼠血清TG、TC、FFA含量的影響模型組大鼠血清TG、TC、FFA的含量(1.17±0.096、3.27±0.18、480.475±18.94)明顯高于正常組(0.56±0.084、1.45±0.20、225.71±15.98)(P<0.01

7、)。經(jīng)用藥干預(yù)，各用藥組均能顯著降低模型大鼠血清TC、TG、FFA含量，與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.01)。其中高劑量組大鼠血清TG、TC、FFA含量(0.52±0.065、1.44±0.11、221.43±15.32)和低劑量組(0.57±0.32、1.56±0.63、241.42±16.96)較對照組(0.76±0.07、2.06±0.28、331.90±16.32)均明顯降低(P<0.01)，而高、低劑量組之間經(jīng)統(tǒng)計學處

8、理無明顯差異(P>0.05)。 2.消瘀化痰飲對NAFLD大鼠AST、ALT活性的影響模型組大鼠血清AST、ALT的活性(32.37±2.45、15.84±1.01)明顯高于正常組(26.59±2.33、10.89±0.86)(P<0.01)。經(jīng)用藥干預(yù)，各用藥組大鼠血清AST、ALT的活性均有明顯的下降，與模型組比較，差異有顯著性(P<0.01)。其中低劑量組AST的活性(19.45±1.90)較對照組(23.19±1.78)

9、低(P<0.05)，高劑量組ALT活性(4.16±0.89)高于對照組(7.32±0.45)(P<0.05)；而高、低劑量組之間AST、ALT的活性經(jīng)統(tǒng)計學處理無明顯差異(P>0.05)。 3.消瘀化痰飲對NAFLD大鼠肝臟TG、TC的影響模型組大鼠肝臟TG、TC的含量(0.82±0.08、0.44±0.07)明顯高于正常組(0.45±0.05、0.27±0.04)(P<0.01)。經(jīng)用藥干預(yù)，各用藥組均能顯著降低模型大鼠肝組織

10、TG、TC的含量(P<0.01)。其中高劑量組TC的含量(0.27±0.04)低于對照組(0.34±0.05)(P<0.05)，而高、低劑量組TC的含量經(jīng)統(tǒng)計學處理無明顯差異(P>0.05)；各用藥組TG的含量經(jīng)統(tǒng)計學處理無明顯差異(P>0.05)。 4 肝組織形態(tài)學改變光鏡可見：正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈大而壁薄，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細胞呈多邊形。模型組大鼠肝細胞中度細胞水腫，少

11、量的肝細胞壞死，多數(shù)肝細胞內(nèi)可見大小不等、數(shù)量不一的脂滴空泡(脂肪變性)，重度變性者，脂滴空泡融合，呈現(xiàn)中至重度脂肪變性，但未見明顯的纖維化改變。各用藥組動物肝小葉和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，高、低劑量組肝細胞內(nèi)脂滴空泡基本消失，對照組中少量的肝細胞內(nèi)仍有脂滴空泡，并有輕度的細胞水腫。 透射電鏡可見：正常組大鼠肝臟細胞質(zhì)中線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等基本正常；模型組細胞質(zhì)內(nèi)充滿了大、小不同的脂滴，線粒體全部脊融合、消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有輕度脫顆?，F(xiàn)象

12、。對照組細胞胞漿內(nèi)可見大、小不等脂滴，線粒體腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有部分斷裂現(xiàn)象。高、低劑量組上述情況明顯改善，肝細胞胞漿有少量脂滴，線粒體形態(tài)基本正常，脊數(shù)目明顯增多，僅部分可見輕度腫脹變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本正常。 第二部分消瘀化痰飲對NAFLD大鼠肝組織UCP2表達的影響1 各組大鼠肝組織ATP含量的變化模型組大鼠肝組織ATP的含量(2.78±0.16)明顯低于正常組(4.66±0.12)(P<0.01)。經(jīng)用藥干預(yù)后，各用藥組大鼠ATP的

13、含量均高于模型組(P<0.01)。其中，高、低劑量組大鼠肝組織ATP的含量(4.57±0.13、4.39±0.19)明顯高于對照組(4.24±0.16)(P<0.01)；高劑量組大鼠肝組織ATP的含量高于低劑量組(P<0.01)。 2 各組大鼠肝組織UCP2表達的變化半定量分析顯示：模型組大鼠肝組織UCP2表達的平均灰度(0.0883±0.0079)明顯低于正常組(0.2170±0.0106)(P<0.01)。經(jīng)用藥干預(yù)后，各用藥組大鼠

14、肝組織的平均灰度均高于模型組(P<0.01)。其中，高、低劑量組平均灰度(0.1627±0.0130、0.1310±0.0046)高于對照組(0.1103±0.0064)(P<0.01)；高劑量組平均灰度高于低劑量組(P<0.01)。 3.各組大鼠肝組織UCP2mRNA表達的變化RT-PCR后，瓊脂糖凝膠電泳，在479bp、587bp處分別顯示出UCP2mRNA和β-actin電泳帶，與預(yù)期結(jié)果一致。模型組大鼠肝組織UCP2mR

15、NA的表達(0.4065±0.0281)顯著高于正常組(0.0944±0.0102)(P<0.01)。給藥后，各用藥組UCP2mRNA的表達顯著低于模型組(P<0.01)，其中，高、低劑量組UCP2mRNA的表達(0.1846±0.01301、0.1790±0.0134)低于對照組的表達(0.2669±0.0208)(P<0.01)，而高、低劑量組之間無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論 1.消瘀化痰飲能顯著降低NAFL

16、D大鼠血清和肝組織內(nèi)異常升高的TC、TG、FFA的含量，抑制血清內(nèi)ALT和AST活性的異常升高，呈現(xiàn)出良好的調(diào)脂護肝作用。 2.消瘀化痰飲可明顯改善NAFLD大鼠肝組織的病變程度，表現(xiàn)為用藥后大鼠肝小葉和肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞內(nèi)脂滴空泡基本消失；線粒體形態(tài)基本正常，脊數(shù)目明顯增多。 3.消瘀化痰飲能抑制NAFLD大鼠肝組織UCP2的過度表達，增加ATP的合成和線粒體的能量貯備，促進脂肪酸代謝，以達到治療NAFLD的目的。