基因芯片技術(shù)分析表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對兩株肝癌耐藥細(xì)胞基因表達(dá)譜影響.pdf

1、肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是廣西常見和高發(fā)的惡性腫瘤。聯(lián)合化療是肝癌治療的重要措施，但化療效果不佳，除與70％肝癌天然耐藥有關(guān)，MDR已成為肝癌治療的最大障礙。目前MDR逆轉(zhuǎn)劑的機(jī)制單一、明顯劑量限制性及體內(nèi)難以達(dá)到所需血藥濃度，其臨床應(yīng)用受到限制，因此，從天然資源中尋求高效、低毒、作用靶點廣泛的耐藥逆轉(zhuǎn)劑已成為當(dāng)前MDR研究的必然趨勢和熱點。MDR的機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞內(nèi)多種蛋白、酶類和基因的改變以及細(xì)胞外環(huán)境的變化。其中以A

2、BC型載體轉(zhuǎn)運蛋白的過度表達(dá)為經(jīng)典機(jī)制，P糖蛋白最具代表。非經(jīng)典機(jī)制可能涉及通過改變特異性酶系統(tǒng)活性降低藥物細(xì)胞毒作用；凋亡相關(guān)調(diào)控途徑受阻；細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化改變；體內(nèi)藥代動力學(xué)因素等。此外，值得注意的是，同一腫瘤不同瘤株產(chǎn)生MDR的機(jī)制也可不同。MDR的產(chǎn)生并不是單一因素導(dǎo)致的，而是多種因素共同作用的結(jié)果。目前研究認(rèn)為，綠茶的兒茶素單體EGCG通過多種途徑抑制腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移，并協(xié)同化療藥物對肝癌MDR細(xì)胞抗增殖、誘導(dǎo)分化和誘導(dǎo)凋亡

3、，具有一定逆轉(zhuǎn)MDR作用。腫瘤MDR機(jī)制的復(fù)雜和EGCG逆轉(zhuǎn)MDR的多途徑，高通量基因芯片技術(shù)探討EGCG逆轉(zhuǎn)肝癌MDR分子作用機(jī)制尚未見報道。 目的：選用兩株不同化療藥物誘導(dǎo)耐藥的肝癌細(xì)胞株，利用基因芯片技術(shù)從肝癌．MDR及EGCG耐藥逆轉(zhuǎn)劑兩個角度對多個參量同時進(jìn)行研究，以探討EGCG的可能耐藥逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制。 內(nèi)容： 1．人肝癌多藥耐藥細(xì)胞系BEL7404/ADM和BEL7402/5FU的培養(yǎng)：BEL7404

4、/ADM細(xì)胞采用濃度梯度遞增和高濃度間歇沖擊法誘導(dǎo)，建立并提高耐藥倍數(shù)，0.5mg/LADM維持；BEL7402/5FU購自于南京凱基生物技術(shù)有限公司，20mg/L 5FU維持。兩株細(xì)胞均在37℃、5％CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10％滅活小牛血清，100U/青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基。 2．甲基四唑藍(lán)(MTT)法藥物敏感性實驗： 2．1分別檢測兩株敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株對多種

5、化療藥物的IC<,50>，確定相應(yīng)耐藥指數(shù)。 2．2分別檢測EGCG對兩株耐藥細(xì)胞的毒性作用，根據(jù)LOGIT軟件求得10％的細(xì)胞生長受到抑制所需藥物濃度(IC<,10>)。選取低于IC<,10>的EGCG濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)耐藥性濃度依賴實驗，并確定最佳逆轉(zhuǎn)濃度劑量。 3．基因芯片分析最佳逆轉(zhuǎn)濃度EGCG作用兩株肝癌耐藥細(xì)胞的基因表達(dá)譜的差異，探討EGCG的可能耐藥逆轉(zhuǎn)作用分子機(jī)制。 3．1表達(dá)譜cDNA微陣列的制備。從

6、IMAGE人類cDNA文庫直接點樣8064個靶基因，另挑選10個與肝癌耐藥相關(guān)靶基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和純化后制備成探針，點樣、水合、紫外交聯(lián)于氨基玻片上，制備成表達(dá)譜cDNA微陣列。 3．2 EGCG作用兩株肝癌耐藥細(xì)胞的基因表達(dá)譜差異兩株肝癌耐藥細(xì)胞株分別分組：對照耐藥細(xì)胞組和最佳逆轉(zhuǎn)濃度EGCG作用48h耐藥細(xì)胞組和，抽提總RNA，分離純化為mRNA，逆轉(zhuǎn)錄Cy5/Cy3標(biāo)記cDNA探針，與基因微陣列雜交并掃描分析。

7、 4．Western Blot方法分別檢測相同處理條件下兩株肝癌耐藥細(xì)胞的Cyclin G1蛋白表達(dá)的變化，驗證基因芯片CCNG1基因表達(dá)變化結(jié)果。 結(jié)果： 1．培養(yǎng)的ADM誘導(dǎo)耐藥肝癌細(xì)胞BEL7404/ADM對ADM明顯抗藥性，耐藥指數(shù)為39.6，對VCR、CDDP交叉抗藥性、對5FU抗藥性不明顯。BEL7402/5fu細(xì)胞對5FU耐藥指數(shù)為127.6，對ADM有交叉抗藥性，對CDDP、VCR抗藥性不明顯。

8、 2． EGCG對BEL7404/ADM、BEL7402/5FU的IC<,10>分別為24.76 mg/L、20.60 mg/L，因此選擇7mg/L、15mg/L、20 mg/L三個濃度進(jìn)行逆轉(zhuǎn)耐藥性濃度依賴實驗，5mg/LVRP作陽性逆轉(zhuǎn)劑對照。結(jié)果顯示，三個濃度EGCG聯(lián)合相應(yīng)化療藥物均能增加肝癌耐藥細(xì)胞株對化療藥物敏感性。對BEL7404/ADM耐藥細(xì)胞株，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.69倍、5.37倍、9.66倍，與陽性逆轉(zhuǎn)劑VRP(5

9、mg/L)相比逆轉(zhuǎn)倍數(shù)6.48倍；對BEL7402/5FU耐藥細(xì)胞株，EGCG聯(lián)合5FU作用IC<,50>。下降不顯著，陽性逆轉(zhuǎn)劑VRP IC<,50>。下降無顯著性。 3．選用20mg/L濃度EGCG進(jìn)行基因芯片機(jī)制探討實驗。芯片結(jié)果：不同組樣品間表達(dá)差異基因的功能主要涉及細(xì)胞生長調(diào)節(jié)有關(guān)的細(xì)胞增殖和凋亡基因、DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄基因、癌基因/抑癌基因以及細(xì)胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面。EGCG作用BEL7404/ADM細(xì)胞雙熒光通路

10、顯著差異基因210個，上調(diào)表達(dá)38個，下調(diào)表達(dá)172個?？赡芘c耐藥機(jī)制相關(guān)基因變化：ABCB10(MDR/TAP)、TOP2A、TOP2B、CCNG1上調(diào)，ABCB1、MVP、ARHD、HDAC5、GSS、GSTPI、HSPA1B、HSPB7、CDKN1A、RAB11B、RAB9P40下調(diào)等；EGCG作用BEL7402/5FU細(xì)胞雙熒光通路顯著差異基因179個，上調(diào)表達(dá)31個，下調(diào)表達(dá)148個?？赡艿臋C(jī)制相關(guān)基因變化：ABCG(BCRP

11、)、CCNG2、GADD34、RB1、RBBP4上調(diào)，DTYMK、GPX1、USP5、BAX、BAK1、HSPAIL下調(diào)等。 4． Western blot實驗相同處理條件下兩組肝癌耐藥細(xì)胞的Cyclin G1蛋白表達(dá)均增加，與cDNA microarray基因水平變化一致。 結(jié)論： 1．EGCG多基因、多環(huán)節(jié)、多途徑改變參與逆轉(zhuǎn)ADM誘導(dǎo)的肝癌MDR，涉及編碼經(jīng)典轉(zhuǎn)運蛋白基因，ABCB1、ARHD、HDAC5基

12、因下調(diào)MDRl基因降低P-gp表達(dá)；ABC膜跨膜蛋白基因家族如MVP、ABCD10(MDR/TAP)基因變化。對非經(jīng)典耐藥途徑基因影響，如編碼TOPO酶、GSH-GST系統(tǒng)、HSP70、PKC、MMP系列基因變化，存在多靶點作用。 2．EGCG對5FU誘導(dǎo)的肝癌MDR逆轉(zhuǎn)作用不明顯，與5FU耐藥機(jī)制不同于經(jīng)典跨膜轉(zhuǎn)運蛋白有關(guān)，可能與影響細(xì)胞周期關(guān)卡調(diào)控靶點、調(diào)控細(xì)胞凋亡基因失調(diào)有關(guān)。 3．非細(xì)胞毒劑量的EGCG可能是協(xié)同