表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的微囊制備工藝研究及急性毒性評價.pdf

1、[目的] 研究抗禽流感病毒新藥EGCG的微囊制備工藝；建立原料和微囊的質控標準；考察EGCG固體粉末在不同條件下的穩(wěn)定性。 通過急性毒性評價，測定EGCG的LD<,50>和探討其致死機理。 [方法] 以溶出度為評價指標，采用均勻設計進行EGCG微囊制備工藝的處方篩選；采用對照品對照法將EGCG原料進行成分的鑒別和含量的測定，而后測定此樣品有關的理化常數(shù)以確保原料來源穩(wěn)定；在高熱，熔融，強酸、堿、氧等環(huán)境下

2、考察EGCG原料的穩(wěn)定性，按照中國藥典(2005版)的指導原則進行原料藥的影響因素實驗；外觀性狀改變使用HPLC、MS、TGA、UV、IR、XRD等儀器分析手段進行鑒定； 按照經典的寇氏法設計實驗，進行EGCG的急性毒性評價，由于預實驗沒有發(fā)現(xiàn)♀、♂小鼠間有性別差異，故選擇了♀小鼠通過口服給藥，測定小鼠的LD<,50>，主要臟器制作石蠟切片，觀察EGCG所致的病理改變。 [結果] (1)微囊的制備工藝：

3、以微囊制備所用主藥和輔料的配方為因素，各種配方的配比為水平，以15min溶出度為評價指標，按照均勻設計得到的多元回歸方程是Y=43.8—1.43A+4.35B+65.2C+28.2D，R=0.9459，F(xiàn)=8.496>F(0.05，4，4)=6.388，進行處方篩。處方為:EC含量為5.5％，主藥和囊材重量比為2:1，加入致孔劑和EC重量比1:11，促釋放劑和主藥重量比0.2:1。采用常壓蒸餾法分離制備微囊過程中使用的有機溶劑，解決三廢

4、處理的問題。 (2)原料藥質量控制： 采用對照品對照法鑒定，樣品和對照品(sigma)兩者的熔點一致都為216℃左右，它們的等量混合物熔點和熔程沒有變化：兩者的HPLC保留時間同為15.25min左右，外標法測定樣品含量為95.6％；兩者的IR圖譜表明各個基團的彎曲和伸縮振動一致。用UV法測定摩爾吸光系數(shù)是8038.22L/mol℃m，EGCG在水中平衡溶解度為60.5mg/ml。 考察EGCG原料的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，

5、EGCG在熔融狀態(tài)下同時分解，強酸、氧化劑條件下不穩(wěn)定EGCG原色譜峰面積減少，堿性條件溶液立刻變深紅，HPLC原色譜峰消失；考察原料藥穩(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)，高溫、高濕、強光會使EGCG由白色變成粉色，沒有發(fā)現(xiàn)相應的色譜圖出現(xiàn)新的物質。EGCG在130℃干燥至恒重，類白色的固體粉末變成粉色，TGA表明EGCG在100℃左右重量減少4.1％，140℃～210V恒重呈粉色，但用HPLC、MS、UV、IR等儀器進行測定時，發(fā)現(xiàn)粉色粉末和白色的

6、原料粉末譜圖一致，僅有XRD圖顯示出明顯的不同。 (3)EGCG微囊質量控制：建立了反相HPLC測定微囊中EGCG含量的方法，回收率為99.53％，重復性RSD=0.75％，制備空白囊同條件測定，發(fā)現(xiàn)所選用的輔料對EGCG的含量測定沒有干擾，在此基礎上我們計算微囊的載藥量為50.51％，包封率為96.3％。按照我們研究的工藝制備EGCG休止角在30°左右，有機殘留<600μg/g，溶出度實驗顯示微囊在1h內可以溶出80％以上，2

7、h完全溶出。 考察微囊穩(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)EGCG微囊的HPLC圖沒有新的色譜峰。 (4)EGCG急性毒性評價： 測定口服LD<,50>=1267.74mg/kg(成年BALB/C小鼠)，病理切片發(fā)現(xiàn)EGCG一次口服是有毒性的，毒性主要發(fā)生在7天內，可引起心、肝、腎等主要臟器的病理改變。急性死亡一般在4h內出現(xiàn)，觀察到心肌細胞出現(xiàn)大范圍的變性，胞質深紅染，細胞核深染，縱肌層中心肌細胞出現(xiàn)斷裂。 EGCG的

8、劑量不同引起小鼠死亡時間的不同，一般發(fā)生在2～5天，引起肝竇和匯管區(qū)的血管充血、出血、肝細胞壞死等過程；腎臟依此出現(xiàn)腎小球和間質充血、出血、腎小球萎縮、腎小管水腫，出現(xiàn)蛋白管型，但腎臟的病變過程隨時間變化不明顯。 【結論】 (1)此工藝穩(wěn)定，所需設備簡單，成品流動性好、溶出度可控、有機溶劑含量達到美國藥典要求，成功解決了EGCG原粉末吸濕性、流動性差的問題，終產品中沒有發(fā)現(xiàn)對EGCG穩(wěn)定性有影響?？梢砸源藶樗幬镏苿┻M行動

9、物實驗，為開發(fā)抗禽流感病毒的新藥打下基礎。 (2)我們確定購買的EGCG原料和sigma的對照品成分一致，含量為95.6％，可用于本實驗的微囊制備。EGCG原料水溶液在可見光部分沒有吸收，肉眼觀無色透明，摩爾吸光系數(shù)大，在此波長下可以進行含量測定。在穩(wěn)定性實驗過程中，發(fā)現(xiàn)EGCG在酸、氧化劑的條件下不穩(wěn)定，在堿性環(huán)境不能存在；影響因素實驗和光照、強熱實驗都發(fā)現(xiàn)EGCG會變成粉色，40℃低溫、76％低濕不明顯，經儀器分析驗證沒有發(fā)

10、現(xiàn)有新的降解產物出現(xiàn)，只發(fā)現(xiàn)XRD圖不一樣有可能是EGCG固體晶體結構的改變從而影響表觀顏色的改變。提示我們EGCG固體原料穩(wěn)定，在保存過程中要注意水分的控制，避免堿性環(huán)境。(3)HPLC測定微囊中EGCG含量的方法穩(wěn)定可靠，可用于EGCG微囊的含量測定，此工藝制備微囊產率很高，消耗少。微囊流動性好，有機殘留達到美國藥典(26版)規(guī)定，溶出度實驗顯示微囊能很快溶出并且沒有新的物質產生?？疾煳⒛曳€(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)EGCG微囊穩(wěn)定，沒有發(fā)