表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的微囊制備工藝研究及急性毒性評(píng)價(jià).pdf

1、[目的] 研究抗禽流感病毒新藥EGCG的微囊制備工藝；建立原料和微囊的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；考察EGCG固體粉末在不同條件下的穩(wěn)定性。 通過急性毒性評(píng)價(jià)，測(cè)定EGCG的LD<,50>和探討其致死機(jī)理。 [方法] 以溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行EGCG微囊制備工藝的處方篩選；采用對(duì)照品對(duì)照法將EGCG原料進(jìn)行成分的鑒別和含量的測(cè)定，而后測(cè)定此樣品有關(guān)的理化常數(shù)以確保原料來源穩(wěn)定；在高熱，熔融，強(qiáng)酸、堿、氧等環(huán)境下

2、考察EGCG原料的穩(wěn)定性，按照中國(guó)藥典(2005版)的指導(dǎo)原則進(jìn)行原料藥的影響因素實(shí)驗(yàn)；外觀性狀改變使用HPLC、MS、TGA、UV、IR、XRD等儀器分析手段進(jìn)行鑒定； 按照經(jīng)典的寇氏法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行EGCG的急性毒性評(píng)價(jià)，由于預(yù)實(shí)驗(yàn)沒有發(fā)現(xiàn)♀、♂小鼠間有性別差異，故選擇了♀小鼠通過口服給藥，測(cè)定小鼠的LD<,50>，主要臟器制作石蠟切片，觀察EGCG所致的病理改變。 [結(jié)果] (1)微囊的制備工藝：

3、以微囊制備所用主藥和輔料的配方為因素，各種配方的配比為水平，以15min溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照均勻設(shè)計(jì)得到的多元回歸方程是Y=43.8—1.43A+4.35B+65.2C+28.2D，R=0.9459，F(xiàn)=8.496>F(0.05，4，4)=6.388，進(jìn)行處方篩。處方為:EC含量為5.5％，主藥和囊材重量比為2:1，加入致孔劑和EC重量比1:11，促釋放劑和主藥重量比0.2:1。采用常壓蒸餾法分離制備微囊過程中使用的有機(jī)溶劑，解決三廢

4、處理的問題。 (2)原料藥質(zhì)量控制： 采用對(duì)照品對(duì)照法鑒定，樣品和對(duì)照品(sigma)兩者的熔點(diǎn)一致都為216℃左右，它們的等量混合物熔點(diǎn)和熔程沒有變化：兩者的HPLC保留時(shí)間同為15.25min左右，外標(biāo)法測(cè)定樣品含量為95.6％；兩者的IR圖譜表明各個(gè)基團(tuán)的彎曲和伸縮振動(dòng)一致。用UV法測(cè)定摩爾吸光系數(shù)是8038.22L/mol℃m，EGCG在水中平衡溶解度為60.5mg/ml。 考察EGCG原料的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，

5、EGCG在熔融狀態(tài)下同時(shí)分解，強(qiáng)酸、氧化劑條件下不穩(wěn)定EGCG原色譜峰面積減少，堿性條件溶液立刻變深紅，HPLC原色譜峰消失；考察原料藥穩(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)，高溫、高濕、強(qiáng)光會(huì)使EGCG由白色變成粉色，沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的色譜圖出現(xiàn)新的物質(zhì)。EGCG在130℃干燥至恒重，類白色的固體粉末變成粉色，TGA表明EGCG在100℃左右重量減少4.1％，140℃～210V恒重呈粉色，但用HPLC、MS、UV、IR等儀器進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)粉色粉末和白色的

6、原料粉末譜圖一致，僅有XRD圖顯示出明顯的不同。 (3)EGCG微囊質(zhì)量控制：建立了反相HPLC測(cè)定微囊中EGCG含量的方法，回收率為99.53％，重復(fù)性RSD=0.75％，制備空白囊同條件測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所選用的輔料對(duì)EGCG的含量測(cè)定沒有干擾，在此基礎(chǔ)上我們計(jì)算微囊的載藥量為50.51％，包封率為96.3％。按照我們研究的工藝制備EGCG休止角在30°左右，有機(jī)殘留<600μg/g，溶出度實(shí)驗(yàn)顯示微囊在1h內(nèi)可以溶出80％以上，2

7、h完全溶出。 考察微囊穩(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)EGCG微囊的HPLC圖沒有新的色譜峰。 (4)EGCG急性毒性評(píng)價(jià)： 測(cè)定口服LD<,50>=1267.74mg/kg(成年BALB/C小鼠)，病理切片發(fā)現(xiàn)EGCG一次口服是有毒性的，毒性主要發(fā)生在7天內(nèi)，可引起心、肝、腎等主要臟器的病理改變。急性死亡一般在4h內(nèi)出現(xiàn)，觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)大范圍的變性，胞質(zhì)深紅染，細(xì)胞核深染，縱肌層中心肌細(xì)胞出現(xiàn)斷裂。 EGCG的

8、劑量不同引起小鼠死亡時(shí)間的不同，一般發(fā)生在2～5天，引起肝竇和匯管區(qū)的血管充血、出血、肝細(xì)胞壞死等過程；腎臟依此出現(xiàn)腎小球和間質(zhì)充血、出血、腎小球萎縮、腎小管水腫，出現(xiàn)蛋白管型，但腎臟的病變過程隨時(shí)間變化不明顯。 【結(jié)論】 (1)此工藝穩(wěn)定，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，成品流動(dòng)性好、溶出度可控、有機(jī)溶劑含量達(dá)到美國(guó)藥典要求，成功解決了EGCG原粉末吸濕性、流動(dòng)性差的問題，終產(chǎn)品中沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)EGCG穩(wěn)定性有影響?？梢砸源藶樗幬镏苿┻M(jìn)行動(dòng)

9、物實(shí)驗(yàn)，為開發(fā)抗禽流感病毒的新藥打下基礎(chǔ)。 (2)我們確定購(gòu)買的EGCG原料和sigma的對(duì)照品成分一致，含量為95.6％，可用于本實(shí)驗(yàn)的微囊制備。EGCG原料水溶液在可見光部分沒有吸收，肉眼觀無色透明，摩爾吸光系數(shù)大，在此波長(zhǎng)下可以進(jìn)行含量測(cè)定。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)EGCG在酸、氧化劑的條件下不穩(wěn)定，在堿性環(huán)境不能存在；影響因素實(shí)驗(yàn)和光照、強(qiáng)熱實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)EGCG會(huì)變成粉色，40℃低溫、76％低濕不明顯，經(jīng)儀器分析驗(yàn)證沒有發(fā)

10、現(xiàn)有新的降解產(chǎn)物出現(xiàn)，只發(fā)現(xiàn)XRD圖不一樣有可能是EGCG固體晶體結(jié)構(gòu)的改變從而影響表觀顏色的改變。提示我們EGCG固體原料穩(wěn)定，在保存過程中要注意水分的控制，避免堿性環(huán)境。(3)HPLC測(cè)定微囊中EGCG含量的方法穩(wěn)定可靠，可用于EGCG微囊的含量測(cè)定，此工藝制備微囊產(chǎn)率很高，消耗少。微囊流動(dòng)性好，有機(jī)殘留達(dá)到美國(guó)藥典(26版)規(guī)定，溶出度實(shí)驗(yàn)顯示微囊能很快溶出并且沒有新的物質(zhì)產(chǎn)生?？疾煳⒛曳€(wěn)定性的影響因素發(fā)現(xiàn)EGCG微囊穩(wěn)定，沒有發(fā)