甘薯莖線蟲誘導(dǎo)cDNA文庫的構(gòu)建與ESTs分析.pdf

1、為了研究甘薯受莖線蟲侵染的分子和細(xì)胞機(jī)制并發(fā)掘與甘薯抗莖線蟲病相關(guān)的基因，本研究從北京市大興區(qū)收獲的病薯上分離得到甘薯莖線蟲，經(jīng)過純化并進(jìn)行表面消毒，用打孔接種莖線蟲的方法，從高抗莖線蟲病品種魯薯3號(hào)、潮薯1號(hào)、濟(jì)114、濟(jì)寧10號(hào)以及皖薯 1 號(hào)等11 個(gè)甘薯品種中，篩選得到抗莖線蟲病擴(kuò)展的品種魯薯3號(hào)、皖薯1號(hào)和潮薯1號(hào)。 以魯薯3號(hào)為材料，利用抑制差減雜交 (SSH) 的方法，構(gòu)建了一個(gè)含有3024個(gè)克隆的正向差減文庫。對(duì)

2、3024個(gè)克隆進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，從中篩選出1379個(gè)陽性克隆，然后進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序成功的 ESTs 進(jìn)行 Cluster 和 Blast 分析，共得到 185 個(gè) unique ESTs，其中包括88個(gè)singletons和97個(gè)contigs。所有的unique ESTS在GenBank上進(jìn)行Blast分析表明，149個(gè)ESTs推斷編碼的蛋白質(zhì)與已知或推測(cè)的蛋白質(zhì)氨基酸序列的相似性很高，其中72個(gè)ESTs與已知的甘薯ESTs有很高的

3、同源性；36個(gè)ESTs在GenBank中搜索不到同源基因，可能代表新基因。經(jīng)“Virluai”Northern blot分析表明，185個(gè)unique ESTs中94個(gè)是差異表達(dá)基因。根據(jù)G0功能分類方法，用Blast2go軟件對(duì)94個(gè)差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分、生物學(xué)過程、分子功能三個(gè)方面進(jìn)行分類，結(jié)果得到含有與植物抗線蟲基因蛋白酶抑制劑活性、抗線蟲基因保守區(qū)域絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性相關(guān)的EST，具有幾丁質(zhì)酶、B-1，3-葡聚糖水解酶