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文檔簡介
1、最近研究發(fā)現(xiàn)大黃具有抗骨質(zhì)疏松的作用,麗江大黃作為中藥大黃的一種,其含有很多活性成分。成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松中起著至關(guān)重要的作用,MC3T3-El細(xì)胞系是一個能夠代表成骨細(xì)胞分化的經(jīng)典模型,常用來做體外藥物篩選研究。本論文通過實(shí)驗(yàn)探討麗江大黃中的幾種成分對MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中的影響及可能機(jī)制,從而為其在骨質(zhì)疏松方面的研究提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。本研究分為兩個部分:第一部分建立小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1分化模型,對每一階段特異性
2、指標(biāo)進(jìn)行檢測以確定MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)成功;第二部分研究中藥麗江大黃中4種活性物質(zhì)脫氧土大黃苷、大黃素、蘆薈大黃素和RDET(含有幾種單體的混合物)對小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖與分化的影響。
選取2種誘導(dǎo)液:誘導(dǎo)液Ⅰ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mmol/l)與誘導(dǎo)液Ⅱ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mmol/l、地塞米松10-8 mol/l);采用堿性磷酸酶(ALP)染色法、茜素紅染
3、色法選取最佳誘導(dǎo)液Ⅱ,再通過免疫組化法檢測骨鈣素含量、馮庫薩染色檢測鈣結(jié)節(jié)等確定誘導(dǎo)建立模型成功;小鼠顱頂前成骨細(xì)胞MC3T3-E1,在誘導(dǎo)液Ⅱ誘導(dǎo)分化的作用下,分化為成骨細(xì)胞,采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測幾種活性成分對分化后的MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用;檢測堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)以及其活性;茜素紅染色法和馮庫薩染色法檢測鈣化結(jié)節(jié);免疫組化法檢測骨鈣素含量;采用RT-PCR檢測活性成分對OPG/RNNKL表達(dá)的影響。
通過
4、染色結(jié)果確定誘導(dǎo)液Ⅱ與誘導(dǎo)液Ⅰ均能將MC3T3-E1誘導(dǎo)成成骨細(xì)胞,但誘導(dǎo)液Ⅱ的效果更佳,因此選取誘導(dǎo)液Ⅱ?yàn)檎T導(dǎo)液。MTT結(jié)果顯示脫氧土大黃苷在10μg/ml以上對MC3T3-E1細(xì)胞有促進(jìn)增殖的影響。RDET與大黃素在40μg/ml以上對MC3T3-E1細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用、蘆薈大黃素沒有明顯的促進(jìn)增殖影響。ALP染色結(jié)果顯示脫氧土大黃苷、蘆薈大黃素、RDET在10μg/ml作用濃度下提高ALP活性,大黃素沒有明顯的作用;而ALP酶活
5、性測定顯示RDET與模型組相差不大。脫氧土大黃苷與RDET可以促進(jìn)骨鈣素減少。茜素紅染色與馮庫薩染色結(jié)果為:蘆薈大黃素與大黃素作用的細(xì)胞所產(chǎn)生的礦結(jié)節(jié)較多,但大黃素作用的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較大的改變。分化早期與中期活性成分對MC3T3-E1細(xì)胞中OPG的增多沒有明顯的效果,晚期會發(fā)現(xiàn)RDET促進(jìn)了OPG數(shù)量的增加。
誘導(dǎo)液Ⅱ(抗壞血酸50μg/ml、β-甘油磷酸鈉10mml/l、地塞米松10-8 mol/l)能更好的誘導(dǎo)MC3T3-
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