維氏氣單胞菌SmpB蛋白對雙組份系統(tǒng)毒力傳感蛋白BvgS啟動子調控的研究.pdf

1、研究表明SmpB蛋白參與細胞眾多生理過程的調節(jié)，如機體新陳代謝、脂多糖生物合成、脂肪酸代謝途徑、致病菌入侵宿主等，其參與的調控作用對于細菌蛋白質合成質量控制、致病菌中毒力系統(tǒng)調控、維持機體正常生長及發(fā)育等過程具有關鍵作用。
　　本論文以致病菌維氏氣單胞菌作為實驗模式菌，對其SmpB蛋白調節(jié)雙組份系統(tǒng)毒力傳感蛋白BvgS啟動子現(xiàn)象與機制進行探索，取得了以下結果：
　　1、使用增強型綠色熒光蛋白(eGFP)作為報告基因，與Bvg

2、S啟動子融合構建載體 pDH114，同時構建表達維氏氣單胞菌 SmpB的質粒，將其共轉化到△tmRNA△SmpB E.coli Feldon中，通過測定Flu/OD600值的強弱來表征BvgS表達量的變化。結果表明維氏氣單胞菌SmpB蛋白對BvgS啟動子具有正調控作用。
　　2、進一步利用維氏氣單胞菌SmpB蛋白截短突變體△N34和△C30以及定點突變體G11S12→A11A12，T14I15→A14A15，F(xiàn)26I27→A26A

3、27，E32A33G34→A32A33A34， G133K134→A133A134，D138K139R140→A138A139A140，K152→P152，探究影響其功能的關鍵區(qū)域與關鍵位點。結果發(fā)現(xiàn)N端區(qū)域對于SmpB發(fā)揮功能很關鍵，C端區(qū)域可以影響SmpB功能；G11S12及E32A33G34位點對于SmpB發(fā)揮功能比較重要。
　　3、通過構建 pET-28a(+)-SmpB-His6表達載體、IPTG誘導表達、Ni-瓊脂糖凝

4、膠6FF純化、Western Blot檢測，獲得純化的SmpB蛋白，與BvgS啟動子進行瓊脂糖凝膠遷移實驗。結果顯示SmpB/BvgS啟動子存在滯后現(xiàn)象，表明SmpB蛋白與BvgS啟動子可以特異性的相互作用。
　　4、通過基因敲除獲得維氏氣單胞菌△SmpB和△tmRNA突變株，利用實時定量 PCR技術分別對E.coli Feldon模式菌中BvgS啟動子下 eGFP轉錄本及△SmpB和△tmRNA突變株中BvgS基因轉錄本進行檢測