慢性腎衰竭大鼠早期脂肪沉積的動(dòng)態(tài)變化及核心蛋白聚糖基因治療.pdf

1、目的:
　　本研究主要探討早期腎衰竭大鼠主動(dòng)脈脂肪沉積及血液中脂肪譜濃度變化，及其引發(fā)心血管并發(fā)癥的機(jī)制;分子水平闡明核心蛋白聚糖基因治療慢性腎衰竭的療效，以及是否能夠防治并發(fā)的脂質(zhì)代謝紊亂、心血管并發(fā)癥，探討可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備與分組
　　共186只成年SD大鼠，96只雄性，90只雌性，均購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，體重約150g-200g。在無菌條件下應(yīng)用兩步法，行5/6腎切除手術(shù)制

2、造腎衰竭大鼠模型。假手術(shù)組僅僅切開腹腔，再立即縫合，保留腎臟。兩部分實(shí)驗(yàn)入組大鼠共168只，其余18只根據(jù)需要，同等條件制造相應(yīng)模型，作為意外死亡大鼠的補(bǔ)充。
　　2.相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)
　　2.1第一部分實(shí)驗(yàn)
　　2.1.1實(shí)驗(yàn)分組:
　　實(shí)驗(yàn)組，接受真正的兩步法行5/6腎切除手術(shù)制造腎衰竭大鼠模型，n=24;對(duì)照組，僅僅接受手術(shù)切開腹腔皮膚，但保留腎臟，即假手術(shù)組，n=24。分別在第0天、第10天、第30天、第6

3、0天處死6只大鼠，用于取主動(dòng)脈弓檢測(cè)脂肪沉積情況。第40天時(shí)不處死，僅抽血。
　　2.1.2血漿、紅細(xì)胞膜及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化
　　采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第40天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞膜磷脂的動(dòng)態(tài)變化。
　　采集檢測(cè)第0天、第10天、第30天、第60天血漿甘油三酯、總膽固醇、磷脂的動(dòng)態(tài)濃度變化，以及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化。
　　其中血漿甘油三酯的檢測(cè)采用甘油-3-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法

4、（PAP法），總膽固醇采用鉬酸銨還原法，紅細(xì)胞膜脂肪、主動(dòng)脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，總膽固醇采用鉬酸銨還原法，磷脂則采用酸消化后，采用鉬藍(lán)比色法先檢測(cè)出無機(jī)磷濃度，在采用無機(jī)磷與磷脂的換算系數(shù)計(jì)算得出。其他生化指標(biāo)如血肌酐則采用PAP比率法。
　　2.2第二部分實(shí)驗(yàn)
　　2.2.1實(shí)驗(yàn)分組
　　A組，30只大鼠，行假手術(shù)，保留腎臟;其余均接受真手術(shù)制造腎衰竭大

5、鼠模型。所有大鼠在手術(shù)后均可自由進(jìn)飲食;等到真手術(shù)組大鼠腎衰竭模型建立成功，則進(jìn)一步隨機(jī)分組，1）B組，手術(shù)對(duì)照組，不接受任何治療，n=30;2）C組，空白治療對(duì)照組，僅僅接受空白載體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞[FB(LXSN)cells]治療，n=30;3）D組，治療組，接受核心蛋白聚糖載體轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞[FB(LDCNSN)cells]治療，n=30。分別在第0天、第10天、第20天、第30天、第60天每組處死6只大鼠，用于取腎臟組織、主動(dòng)

6、脈弓。第40天時(shí)只抽血，不處死。
　　2.2.2顯微鏡觀察腎臟病理變化
　　觀察第0天、第30天、第60天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的變化。采用HE、PAS、Masson染色等應(yīng)用普通光鏡觀察腎臟病理變化，采用半定量分級(jí)法:0，正常;Ⅰ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）≤30％;Ⅱ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）31-60％;Ⅲ，腎臟病變（腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化）≥61％。
　　2.2.3成纖維細(xì)胞

7、的培養(yǎng)及注射
　　FB(LDCNSN)和FB(LXSN)細(xì)胞均在改良的良伊格爾DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（含300ng/ml的G418與10％的胎牛血清）中孵育培養(yǎng)。DCN轉(zhuǎn)染的載體導(dǎo)入FB細(xì)胞，培養(yǎng)成FB(LDCNSN)細(xì)胞，空白載體導(dǎo)入FB細(xì)胞，培養(yǎng)成FB(LXSN)細(xì)胞，后應(yīng)用乙二胺四乙酸-胰蛋白酶消化收集，然后應(yīng)用高壓無菌生理鹽水沖洗3次。將細(xì)胞濃度調(diào)整到1X106/ml，采用多點(diǎn)注射法注射到腎髓質(zhì)，使之達(dá)到約1X106/腎的注射

8、量。
　　2.2.4甘油三酯、總膽固醇、總磷脂、血肌酐、尿素氮的測(cè)定
　　均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞膜總膽固醇、總磷脂的動(dòng)態(tài)變化。
　　均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天、第60天血脂及主動(dòng)脈弓脂肪的動(dòng)態(tài)變化。
　　均采集檢測(cè)第0天、第10天、第20天、第30天和第60天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血肌酐、尿素氮的動(dòng)態(tài)變化。
　　其中血漿甘油三酯的檢測(cè)采用甘油-3

9、-磷酸氧化-苯酚-氨基比林法（PAP法），總膽固醇采用鉬酸銨還原法，紅細(xì)胞膜脂肪、主動(dòng)脈脂肪均先采用Rose-Gottlieb提取法提取出脂肪，其后甘油三酯仍采用PAP法，總膽固醇采用鉬酸銨還原法，磷脂則采用酸消化后，采用鉬藍(lán)比色法先檢測(cè)出無機(jī)磷濃度，在采用無機(jī)磷與磷脂的換算系數(shù)計(jì)算得出。其他生化指標(biāo)如血肌酐則采用PAP比率法。
　　2.2.5腎組織中核心蛋白聚糖(DCN)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的檢測(cè)
　　檢測(cè)第

10、0天、第30天、第60天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)二者在腎組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。EnVisionTM免疫組化系統(tǒng)用于檢測(cè)腎組織中的DCN與TGF-β1的表達(dá)。
　　具體過程:脫蠟、微波修復(fù)抗原10min、每個(gè)玻片加1滴3％雙氧水、室溫孵育20min、加一抗(兔抗鼠單克隆抗TGF-β1抗體、兔抗鼠單克隆抗DCN)、1∶200稀釋、室溫孵育2h，磷酸緩沖鹽水(PBS)漂洗5minX3次、加抗生物素蛋白、室溫孵育20min、PBS漂洗3min、加辣根過

11、氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，、室溫孵育30min、PBS漂洗5minX3次、加3，3'-二氨基聯(lián)苯胺、光鏡觀察5min、加用蘇木精復(fù)染和01.％鹽酸保存、流動(dòng)水水沖洗、顯藍(lán)色、乙醇梯度脫水、加二甲苯、樹膠封片、空氣風(fēng)干。
　　觀察DCN與TGF-β1的表達(dá)，采用半定量觀察其分布法:0，沒有染色;1，偶然有染色;2，局灶性染色;3，彌漫性染色。
　　3.統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)值以x±s表示

12、，根據(jù)需要選用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)或單因素方差分析及線性相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)組BUN和Scr濃度在第10天達(dá)到最高(分別為26.56±2.16 mmol/l和308.50±15.73μmol/l)。濃度在第20天開始下降，第40天值最低（分別為16.22±3.57mmol/l和193.45±20.32μmol/l）;不過，這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的濃度都

13、比對(duì)照組的要高（分別為7.89±2.58 mmol/l和91.22±19.73μmol/l）(P＜0.01)。BUN和Scr濃度在第60天再次升高。
　　實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈弓三種脂肪成分甘油三酯、總膽固醇、磷脂均在第10天時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，甘油三酯在第30天、60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)?？偰懝檀?、總磷脂在第10天時(shí)開始升高，在第60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.05)。血漿TG和T-Ch水平與主動(dòng)脈組

14、織中相應(yīng)脂質(zhì)水平顯著正相關(guān)(r=0.944和r=0.937)，而血漿T-PL水平剛與主動(dòng)脈組織中T-PL水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.832)。
　　實(shí)驗(yàn)組血漿中甘油三酯、總膽固醇均在第10天開始升高，并持續(xù)升高，在第10天、第30天、第40天、第60天時(shí)均高于對(duì)照組(P＜0.05)。總磷脂在第10天時(shí)明顯升高，然后在第20天、30天時(shí)降低，在第60天時(shí)復(fù)又開始輕度升高。
　　實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞膜總膽固醇在第10天開始升高，在第40天

15、、60天時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，紅細(xì)胞膜總磷脂在第20天時(shí)較對(duì)照組輕度降低(P＜0.05)，在第40天、60天時(shí)則較對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)。紅細(xì)胞膜中T-Ch的水平與血漿T-Ch水平顯著正相關(guān)(r=0.946)。
　　2.第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后，D組在第10天之后的各時(shí)間點(diǎn)血尿素氮、血肌酐均較B組與C組上升幅度明顯變小(P＜0.05)，但仍較A組上升(P＜0.05)。D組在第30天

16、和第60天DCN在腎組織中表達(dá)較B組、C組均明顯增加(P＜0.01)。D組中TGF-β1表達(dá)在第30天和第60天則較B、C組均有所減少(P＜0.05)，但仍較A組仍明顯增加(P＜0.05)，B組、C組與本組第0天及A組比較亦明顯增加(P＜0.01)
　　采用核心蛋白聚糖治療干預(yù)后，D組在第30天、60天血脂成分升高幅度均低于B組與C組(P＜0.01)，亦較A組升高，差異程度小于與B組及C組的差異(P＜0.05)，主動(dòng)脈弓血脂變化與

17、血脂類似，D組紅細(xì)胞膜總膽固醇在第20天開始升高，在第30天、60天明顯升高，但升高幅度均小于B組與C組(P＜0.05)，磷脂則在第20天開始降低，第30天、60天時(shí)明顯降低，降低幅度亦明顯小于B組與C組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　早期慢性腎衰竭大鼠血脂升高，主動(dòng)脈脂肪沉積增加，發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)增加。紅細(xì)胞膜膽固醇增加，磷脂降低，膜的僵硬程度增加，變形能力變差。
　　應(yīng)用核心蛋白聚糖基因治療后，不但能延緩腎