芳維A酸乙酯對(duì)銀屑病樣小鼠模型的藥效學(xué)試驗(yàn).pdf

1、目的：檢驗(yàn)芳維A酸乙酯(Arotinoid Ethylester，AE)對(duì)小鼠銀屑病樣模型在抗表皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)異常增生的表皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)表皮顆粒層細(xì)胞增生、抑制炎癥、抑制中性粒細(xì)胞(PMN)趨化性等方面的藥效學(xué)作用。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組： 材料與方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 清潔級(jí)成年BALB/c小鼠，雌雄各半，體重20±5g。購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。 2、分組：小鼠隨機(jī)分組如下：

2、2.1組：即銀屑病樣增生模型治療組：230只小鼠隨機(jī)分為7個(gè)試驗(yàn)劑量組，每組30-40只，每組又分3-4個(gè)時(shí)點(diǎn)(0W、2W、4W、6W)組。并設(shè)立正常對(duì)照組(未建模型未用藥組)及模型對(duì)照組(建立模型后未用藥組)，每組10只，雌雄各半。模型建立后，按照不同試驗(yàn)劑量組別分別給予不同藥物灌胃給藥。分別在模型建立當(dāng)日(0W)、給藥后2W、4w、6W各時(shí)點(diǎn)分別取出各試驗(yàn)劑量組(每組10只)小鼠，斷頸處死，取背部皮膚標(biāo)本分成三份，分別用OCT包埋存

3、放于-20℃冰箱、4％福爾馬林固定、-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2.2組：即小鼠耳部炎癥模型治療組： 70只小鼠隨機(jī)分為7個(gè)試驗(yàn)劑量組正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，溶劑對(duì)照組(服植物油組)，陽(yáng)性對(duì)照組(阿維A酸組)，低劑量AE試驗(yàn)組，中劑量AE試驗(yàn)組，高劑量AE試驗(yàn)組)，每組10只，雌雄各半。將50μl的巴豆油滴于各組小鼠右耳(正常對(duì)照組除外)，30分鐘后灌胃給藥。左耳作空白對(duì)照。2小時(shí)后將小鼠斷頸處死，沿耳廓基線(xiàn)剪下左右兩耳，用

4、直徑6mm的打孔器分別在左右耳同一部位打下圓耳片，電子秤稱(chēng)重。 2．3組：即誘導(dǎo)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層細(xì)胞增生組：72只小鼠分二組，每組分別由36只小鼠隨機(jī)分6小組，每小組6只，雌雄各半。所有小鼠每日用棉簽分別蘸取不同藥物涂抹鼠尾10和14次各為一療程。分別處死小鼠36只，在距鼠尾基底部以下2cm處切斷尾巴。切下皮膚，立即在70％酒精中固定，石蠟包埋，作組織學(xué)檢查。 二、小鼠銀屑病樣模型的建立及檢測(cè)： 1、銀屑病樣增生模

5、型于試驗(yàn)前一天用脫毛劑脫去小鼠背部毛。分別于第1天和和第8天于背部脫毛區(qū)(2.5cm×2cm)涂0.75％DMBA(150μg/200μl丙酮液)；第15天起在相同部位涂0.25％巴豆油(50μg/200μl丙酮液)，每周2次，共4周。分別于建模當(dāng)天(0W)、給藥2W、4W、6W后引頸處死各組小鼠，取材備用。 2、對(duì)銀屑病樣增生病變的治療作用的檢測(cè)： 2.1皮膚的IL-8RⅡ(CXCR<,2>)的測(cè)定(免疫組化法)；

6、 2.2皮膚的TNF-α的p75受體的測(cè)定(免疫組化法)； 2.3皮膚的表皮細(xì)胞層數(shù)檢測(cè)(H.E.染色)； 2.4表皮PCNA的測(cè)定(免疫組化法)； 2.5皮膚的Bax的測(cè)定(免疫組化法)。 三、對(duì)小鼠尾部鱗片顆粒細(xì)胞增生誘導(dǎo)的檢測(cè)： 在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察每個(gè)小鼠的尾部鱗片。凡鱗片表皮有連續(xù)成行的顆粒細(xì)胞者，稱(chēng)為有顆粒層形成的鱗片。計(jì)數(shù)每10個(gè)鱗片中有顆粒層形成的鱗片數(shù)，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

7、 四、對(duì)小鼠耳部炎癥模型作用的檢測(cè)： 1、耳重量的檢測(cè)： 將巴豆油造成小鼠耳炎癥模型后予不同藥物灌胃2小時(shí)后，用直徑6mm的打孔器取下的病側(cè)(右耳)與正常對(duì)照側(cè)(左耳)耳殼，立即用電子天平稱(chēng)重，計(jì)算二者重量之差，作為腫脹度，比較各試驗(yàn)劑量組間腫脹度差異的顯著性，并計(jì)算炎癥抑制率。 2、檢測(cè)指標(biāo)： 2．1腫脹度：左右耳重量之差。 2．2炎癥抑制率：(1-實(shí)驗(yàn)組耳腫脹度/對(duì)照組腫脹度)×100％。

8、 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及處理： 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均以x±SD表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析(One Way ANOVA)，計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)。 結(jié)果： 一、對(duì)小鼠銀屑病樣增生病變的治療作用： 1、對(duì)小鼠銀屑病樣增生表皮IL-8RⅡ(CXCR<,2>)的檢測(cè)： (1)模型對(duì)照組IL-8R Ⅱ的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，且表達(dá)量隨巴豆油的不斷刺激而增加；不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)分

9、別為：0(0W)、23±13.64(2W)、46±13.56(4W)、16.11±3.93(6W)。(巴豆油4W以后因刺激大而逐漸減量)。 (2)高劑量AE組IL-8RⅡ的表達(dá)最低，且隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)而呈遞減趨勢(shì)，即有一定的時(shí)間依賴(lài)性；高劑量AE組IL-8RⅡ的表達(dá)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均比中、低劑量AE組低，尤其在給藥后期(6W)與中劑量AE組差異顯著(P<0.05)，呈現(xiàn)一定的劑效性。 (3)陽(yáng)性對(duì)照(阿維A酸)組在給藥初期(2

10、W、4w)表達(dá)IL-8RⅡ明顯少于三個(gè)AE組(P<0.05)，但隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)了高表達(dá)，與三個(gè)AE組比較差異顯著(6W與低、高劑量AE組比較P=0.017/0.038)。 2、對(duì)小鼠銀屑病樣增生表皮TNFR-p75的檢測(cè)： (1)模型對(duì)照組TNFR-p75的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，且表達(dá)量隨巴豆油的不斷刺激而增加；不同時(shí)點(diǎn)的表達(dá)分別為：0(0W)、20.5±8.5(2W)、27.14±11.61(4W)、12.

11、78±6.29(6W)。 (2)給藥早期，三個(gè)AE組及阿維A酸組均明顯抑制TNFR-p75表達(dá)(與模型對(duì)照組比較均P<0.01)。三個(gè)AE組在各時(shí)點(diǎn)都比阿維A酸組表達(dá)量少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：早期(2W)阿維A酸組與高劑量AE組差異明顯(P=0.006)，后期(6W)表達(dá)明顯升高，甚至高于模型對(duì)照組，與低劑量AE組差異顯著(P=0.005)。 (3)三個(gè)AE組表現(xiàn)出：早期高劑量組表達(dá)明顯比低劑量組少(P=0.03)，但隨給藥時(shí)

12、間延長(zhǎng)，晚期中、高劑量組表達(dá)呈增高趨勢(shì)；低劑量組則無(wú)明顯增高，　 3、對(duì)小鼠銀屑病樣增生表皮PCNA的檢測(cè)： (1)三個(gè)AE組抑制表皮PCNA的表達(dá)作用隨劑量增大而呈遞減趨勢(shì)，低劑量組隨時(shí)間延長(zhǎng)抑制作用加強(qiáng)。在6W時(shí)三個(gè)AE組PCNA的表達(dá)分別為：53.2±21.04(高劑量AE組)、46.0±7.38(中劑量．AE組)、27.75±4.94(低劑量AE組)；只有低劑量AE組與模型對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。

13、 (2)阿維A酸組在不同時(shí)間點(diǎn)均能抑制表皮PCNA的表達(dá)，但在給藥后期(6W)抑制作用明顯弱于低劑量AE組。在6W時(shí)PCNA的表達(dá)分別為：35.0±9.48(陽(yáng)性對(duì)照組)、27.75±4.94(低劑量AE組)。 4、對(duì)小鼠銀屑病樣增生表皮Bax的檢測(cè)： (1)三個(gè)AE組均能抑制Bax的表達(dá)，且作用隨劑量升高而有加強(qiáng)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中、高劑量組呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴(lài)性，Bax的表達(dá)隨AE給藥時(shí)間延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

14、 (2)阿維A酸組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)Bax均弱于三個(gè)AE組，與高劑量AE組差異更顯著(P<0.01)。 5、對(duì)小鼠銀屑病樣增生表皮細(xì)胞層數(shù)的檢測(cè)： (1)三個(gè)AE組表現(xiàn)為先促進(jìn)異常增生的表皮進(jìn)一步增生，后抑制增生； 且隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)抑制增生作用加強(qiáng)，與4W時(shí)比較，三個(gè)AE組在6W時(shí)的表皮層數(shù)差異均非常顯著(均為P<0.01)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)效性；同時(shí)又有一定的劑效性：劑量越小，抑制作用越強(qiáng)。表皮層數(shù)分別為：低劑量組

15、：2.0±0(2W)、2.22±0.42(4W)、1.5±0.5(6W)；中劑量組：2.44±0.50(2W)、3.0±0(4W)、2.2±0.6(6W)；高劑量組：2.86±0.35(2W)、3.0±0(4W)、2.2±0.4(6W)。 (2)阿維A酸組開(kāi)始即表現(xiàn)出較好的抑制表皮增生作用，但沒(méi)有明顯隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)而抑制作用加強(qiáng)，顯示其時(shí)效性不如AE。表皮層數(shù)分別為：1.3±0.46(2W)、2.0±0(4W)、1.6±0.49(6W)

16、。 二、對(duì)小鼠耳巴豆油致炎模型的治療作用。 三、對(duì)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層細(xì)胞增生的作用。 結(jié)論： 1、DMBA/巴豆油較成功地誘發(fā)了小鼠表皮銀屑病樣增生模型，其所造成的增殖病變中，KC過(guò)度增生、皮膚炎癥改變以及某些生化、細(xì)胞因子和免疫學(xué)的改變，與銀屑病的改變相似。 2、三個(gè)AE組均有抗炎、抗白細(xì)胞趨化性作用，但用藥早期，較大劑量作用明顯，長(zhǎng)期用藥則高劑量出現(xiàn)炎癥加重反應(yīng)；阿維A酸組在用藥早期作用明

17、顯，但長(zhǎng)期用藥出現(xiàn)明顯的炎癥加重反應(yīng)。 3、AE抑制表皮細(xì)胞增生的藥效既具有時(shí)間依賴(lài)性：用藥時(shí)間越長(zhǎng)，抑制增生的作用越明顯，即有時(shí)效性的特點(diǎn)；又有劑量依賴(lài)性，小劑量組的抑制表皮增生作用更為明顯。阿維A酸開(kāi)始即表現(xiàn)出較明顯的抑制表皮增生作用，但長(zhǎng)期用藥的時(shí)效性不如低劑量AE。 4、AE及阿維A酸對(duì)異常增殖的表皮細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，AE的這種誘導(dǎo)凋亡作用，既有一定的劑效性，又有一定的時(shí)效性：劑量越高，給藥時(shí)間越長(zhǎng)(主要是中