NUP98-IQCG的克隆及功能研究.pdf

1、惡性腫瘤尤其是白血病中常伴隨有非隨機性遺傳學異常，如易位，缺失，倒位和擴增等。近三十多年來，對腫瘤細胞伴隨的特異染色體異常的研究使我們認識了大量在疾病惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用的原癌基因。功能研究顯示這些異常能干擾細胞增殖、分化和成熟的正常調(diào)控途徑，從而在人類腫瘤的發(fā)病機制中起重要作用。因此，分離特異染色體異常所累及的基因，闡明其致病的分子機制及與臨床的關(guān)系，不僅成為腫瘤分子病理學中最引人注目的研究方向之一，而且為白血病和實體瘤的診斷、分型及

2、預后判斷提供了重要依據(jù)。 本實驗室曾在8000余例標本分析的基礎(chǔ)上，在國際上發(fā)現(xiàn)了三種NUP98相關(guān)的染色體易位：急性髓細胞性白血病t(7；11)(p15；p15.5)，t(11；12)(p15.5；q13)和t(1；11)(q23；p15.5)，分別產(chǎn)生NUP98-HOXA9、NUP98-HOXC11、NUP98-PMX1融合基因。最近又與蘇州大學附屬第一醫(yī)院、江蘇省血液研究所合作，在一例伴t(3；11)(q29q13；p15

3、)易位的急性T/髓細胞性白血病患者中克隆了NUP98-IQCG融合基因。進而對所形成的融合蛋白的致白血病機制進行了初步的研究。 第一部分，先是克隆了此例患者染色體易位中所形成的融合基因。根據(jù)患者異常核型的提示做FISH，證實11號染色體上受累基因是NUP98基因。隨后通過3’cDNA末端快速擴增技術(shù)(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)識別了位于3q29的NUP98新的伙伴基因IQCG(IQmot

4、ifcontainingG)。分子生物學分析顯示NUP98基因的13號外顯子與IQCG基因的10號外顯子相融合，發(fā)現(xiàn)同時還存在另一種變異性轉(zhuǎn)錄本(NUP98-IQCG-v)，在NUP98基因的13號外顯子與IQCG基因的10號外顯子之間插入了72bp的一段序列，這2種融合基因轉(zhuǎn)錄本都保留了完整的閱讀框架。應用QRT-PCR方法，分析了IQCG在人類各個組織中的表達，以睪丸和胃組織中的表達最高，心臟和骨髓中的表達最低。IQCG蛋白序列同源

5、性分析顯示，在7個物種(人，黑猩猩，猴子，大鼠，小鼠，雞和蒼蠅)中存在IQCG同源性序列，提示它們在進化中有共同的祖先。人、猴子和鼠的IQCG蛋白中都有coiled-coil和IQ結(jié)構(gòu)域。 第二部分，對NUP98-IQCG融合蛋白致白血病的分子機制進行了初步的探討。1.研究了其對真核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。NUP98-IQCG融合蛋白在用pBIND-GAL4報告系統(tǒng)分析時表現(xiàn)出較強的反式激活特性。體外蛋白結(jié)合試驗(GSTpull-d

6、own)也證實該融合蛋白可與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄共激活物結(jié)合，并且是通過NUP98部分的FG重復片段起作用的。值得注意的是，GSTpull-down試驗也檢測到該融合蛋白與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄共抑制物的結(jié)合。NUP98-IQCG融合蛋白可能干擾了細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。2.研究了NUP98-IQCG融合蛋白在細胞定位的變化。野生型的NUP98定位于核膜及核內(nèi)，野生型的IQCG定位于胞漿，而NUP98-IQCG主要定位于核內(nèi)。當NUP98-IQCG與IQCG共轉(zhuǎn)染時

7、，IQCG與NUP98-IQCG在核內(nèi)有共定位。GSTpull-down試驗證明了NUP98-IQCG可形成同源二聚體，與NUP98或IQCG形成異源二聚體。這些蛋白質(zhì)間的相互作用可能導致了IQCG部分進入到核內(nèi)。盡管IQCG在核內(nèi)所起的作用尚不清楚，但與所有的NUP98-非同源盒融合基因一致，NUP98-IQCG中也保留了coiled-coil結(jié)構(gòu)域，其可促進與轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子的結(jié)合，可能參與對下游靶基因的調(diào)控。 為了研究N

8、UP98-IQCG融合蛋白在細胞水平上的生物學行為，構(gòu)建了穩(wěn)定表達NUP98-IQCG的細胞株：32Dcl3-NUP98-IQCG/32Dcl3-EV和HL60-NUP98-IQCG/HL60-EV。結(jié)果顯示NUP98-IQCG能阻滯rhG-CSF誘導的32Dcl3細胞向成熟粒細胞的分化；還能抵抗Ara-C(cytarabine)誘導的凋亡，在HL60細胞株中能耐受去除血清對細胞增殖的抑制作用；但NUP98-IQCG也抑制細胞增殖。這些