NUP98-IQCG的克隆及功能研究.pdf

1、惡性腫瘤尤其是白血病中常伴隨有非隨機(jī)性遺傳學(xué)異常，如易位，缺失，倒位和擴(kuò)增等。近三十多年來(lái)，對(duì)腫瘤細(xì)胞伴隨的特異染色體異常的研究使我們認(rèn)識(shí)了大量在疾病惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用的原癌基因。功能研究顯示這些異常能干擾細(xì)胞增殖、分化和成熟的正常調(diào)控途徑，從而在人類腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。因此，分離特異染色體異常所累及的基因，闡明其致病的分子機(jī)制及與臨床的關(guān)系，不僅成為腫瘤分子病理學(xué)中最引人注目的研究方向之一，而且為白血病和實(shí)體瘤的診斷、分型及

2、預(yù)后判斷提供了重要依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)室曾在8000余例標(biāo)本分析的基礎(chǔ)上，在國(guó)際上發(fā)現(xiàn)了三種NUP98相關(guān)的染色體易位：急性髓細(xì)胞性白血病t(7；11)(p15；p15.5)，t(11；12)(p15.5；q13)和t(1；11)(q23；p15.5)，分別產(chǎn)生NUP98-HOXA9、NUP98-HOXC11、NUP98-PMX1融合基因。最近又與蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院、江蘇省血液研究所合作，在一例伴t(3；11)(q29q13；p15

3、)易位的急性T/髓細(xì)胞性白血病患者中克隆了NUP98-IQCG融合基因。進(jìn)而對(duì)所形成的融合蛋白的致白血病機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。 第一部分，先是克隆了此例患者染色體易位中所形成的融合基因。根據(jù)患者異常核型的提示做FISH，證實(shí)11號(hào)染色體上受累基因是NUP98基因。隨后通過(guò)3’cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)識(shí)別了位于3q29的NUP98新的伙伴基因IQCG(IQmot

4、ifcontainingG)。分子生物學(xué)分析顯示NUP98基因的13號(hào)外顯子與IQCG基因的10號(hào)外顯子相融合，發(fā)現(xiàn)同時(shí)還存在另一種變異性轉(zhuǎn)錄本(NUP98-IQCG-v)，在NUP98基因的13號(hào)外顯子與IQCG基因的10號(hào)外顯子之間插入了72bp的一段序列，這2種融合基因轉(zhuǎn)錄本都保留了完整的閱讀框架。應(yīng)用QRT-PCR方法，分析了IQCG在人類各個(gè)組織中的表達(dá)，以睪丸和胃組織中的表達(dá)最高，心臟和骨髓中的表達(dá)最低。IQCG蛋白序列同源

5、性分析顯示，在7個(gè)物種(人，黑猩猩，猴子，大鼠，小鼠，雞和蒼蠅)中存在IQCG同源性序列，提示它們?cè)谶M(jìn)化中有共同的祖先。人、猴子和鼠的IQCG蛋白中都有coiled-coil和IQ結(jié)構(gòu)域。 第二部分，對(duì)NUP98-IQCG融合蛋白致白血病的分子機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。1.研究了其對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。NUP98-IQCG融合蛋白在用pBIND-GAL4報(bào)告系統(tǒng)分析時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的反式激活特性。體外蛋白結(jié)合試驗(yàn)(GSTpull-d

6、own)也證實(shí)該融合蛋白可與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄共激活物結(jié)合，并且是通過(guò)NUP98部分的FG重復(fù)片段起作用的。值得注意的是，GSTpull-down試驗(yàn)也檢測(cè)到該融合蛋白與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄共抑制物的結(jié)合。NUP98-IQCG融合蛋白可能干擾了細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。2.研究了NUP98-IQCG融合蛋白在細(xì)胞定位的變化。野生型的NUP98定位于核膜及核內(nèi)，野生型的IQCG定位于胞漿，而NUP98-IQCG主要定位于核內(nèi)。當(dāng)NUP98-IQCG與IQCG共轉(zhuǎn)染時(shí)

7、，IQCG與NUP98-IQCG在核內(nèi)有共定位。GSTpull-down試驗(yàn)證明了NUP98-IQCG可形成同源二聚體，與NUP98或IQCG形成異源二聚體。這些蛋白質(zhì)間的相互作用可能導(dǎo)致了IQCG部分進(jìn)入到核內(nèi)。盡管IQCG在核內(nèi)所起的作用尚不清楚，但與所有的NUP98-非同源盒融合基因一致，NUP98-IQCG中也保留了coiled-coil結(jié)構(gòu)域，其可促進(jìn)與轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子的結(jié)合，可能參與對(duì)下游靶基因的調(diào)控。 為了研究N

8、UP98-IQCG融合蛋白在細(xì)胞水平上的生物學(xué)行為，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)NUP98-IQCG的細(xì)胞株：32Dcl3-NUP98-IQCG/32Dcl3-EV和HL60-NUP98-IQCG/HL60-EV。結(jié)果顯示NUP98-IQCG能阻滯rhG-CSF誘導(dǎo)的32Dcl3細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞的分化；還能抵抗Ara-C(cytarabine)誘導(dǎo)的凋亡，在HL60細(xì)胞株中能耐受去除血清對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用；但NUP98-IQCG也抑制細(xì)胞增殖。這些