荷人卵巢癌裸鼠循環(huán)無細胞DNA的來源及其與瘤負荷、凋亡的關系.pdf

1、目的：循環(huán)無細胞DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）是存在于體液中的碎裂的核酸片段。本實驗利用人卵巢癌細胞株SKOV3建立荷人卵巢癌裸鼠移植模型。采用半定量PCR的方法，檢測荷人卵巢癌裸鼠血清和腹水中無細胞DNA的含量，并與腫瘤的重量、凋亡率進行對比，研究人卵巢癌移植瘤裸鼠模型血清及腹水中cfDNA的血流動力學改變，探討cfDNA在卵巢上皮性癌臨床診斷及病情監(jiān)測中的意義。通過檢測荷瘤裸鼠經(jīng)化療前后血清

2、cfDNA水平的變化規(guī)律，并與細胞凋亡進行對比，從而為cfDNA是否可作為無創(chuàng)性的卵巢癌患者病情監(jiān)測及療效觀察的生物學指標提供理論依據(jù)。
　　 方法：將人卵巢癌細胞株SKOV3種植于6-8周齡雌性裸鼠的皮下及腹腔中，觀察裸鼠成瘤和腫瘤生長情況。分別于14天（荷瘤1組），21天（荷瘤2組）和30天（荷瘤3組）取皮下種植瘤模型血清及腫瘤，14天取腹水種植瘤模型血清和腹水。皮下種植瘤模型化療組在種植后第30天用順鉑3mg/kg化療1次

3、，于化療后第1天（化療1組），第3天（化療2組）和第10天（化療3組）取血清及腫瘤。用QIAGEN微量提取試劑盒提取血清及腹水中游離的DNA片段。我們針對臨床常用的診斷和監(jiān)測指標血清CA125蛋白的基因序列設計了擴增產(chǎn)物為101bp、261bp、189bp和336bp大小的四組DNA片段引物。用半定量PCR方法擴增β-actin，CA125-DNA片段和ALU重復片段。腫瘤相關cfDNA的量用ALU247/ALU115來表示，CA125

4、-cfDNA的相對水平用CA125 DNA/β-actin來表示。檢測荷瘤1、2、3組；化療1、2、3組和腹水組的血清及腹水組腹水中cfDNA的含量，并與相應的腫瘤重量進行對比。用TUNNEL法檢測荷瘤3組及化療1、2、3組組織細胞的原位凋亡，將其凋亡率與相應的cfDNA含量進行相關性分析。試驗結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行獨立樣本t檢驗，單因素方差分析，和spearman相關分析進行統(tǒng)計學處理。
　　 結果：
　　

5、 1.各組基因片段在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清及腹水中的表達情況
　　 在人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的血清及腹水中均能檢測到人類特有的基因片段β-actin、ALU115、ALU247以及CA125-cfDNA中的101bp片段。其中78例卵巢癌血清標本中，有41例能檢測到CA125-cfDNA的261bp基因片段，189bp片段含量很少，336bp未能檢測，三個指標相應的β-actin均能檢測出來。故本實驗所作數(shù)據(jù)分析中的CA1

6、25-cfDNA僅就101bp片段進行比較和討論。3AO組（種植3A0細胞株后30天取材）與SKOV3瘤負荷3組（種瘤時間相同）血清中的腫瘤相關cfDNA的含量沒有顯著性差異（t=0.193，P>0.05），CA125-cfDNA的含量沒有顯著性差異（t=-1.423，P>0.05）。腹水組荷瘤裸鼠腹水中的腫瘤相關cfDNA的含量與血清中的含量相比沒有顯著性差異（t=1.412，P>0.05），腹水中的CA125-cfDNA的含量與血清

7、中的含量沒有顯著性差異（t=3.535，P>0.05）。（Table1）。
　　 2.各組人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中cfDNA水平的變化情況及其與瘤負荷的關系
　　 分別于皮下種植SKOV3卵巢癌細胞株后14天（荷瘤1組），21天（荷瘤2組）和30天（荷瘤3組）取人卵巢癌裸鼠移植瘤模型血清中的CA125-cfDNA及腫瘤相關cfDNA，結果發(fā)現(xiàn)血清中的CA125-cfDNA的表達各組間有差異（F=15.191，P<0.

8、05），荷瘤2組高于荷瘤1組，差異有顯著性（P<0.05），荷瘤3組高于荷瘤2組，差異有顯著性（P<0.05）。血清中的腫瘤相關cfDNA的表達各組間有差異（F=52.253，P<0.05），荷瘤2組高于荷瘤1組，差異有顯著性（P<0.05），荷瘤3組高于荷瘤2組，差異有顯著性（P<0.05）。（Table1）。SKOV3瘤負荷1、2、3組裸鼠血清中的CA125-cfDNA101bp片段及腫瘤相關cfDNA與腫瘤重量呈正相關（CA125

9、.cfDNA101bp片段的R=0.830，P<0.05腫瘤相關cfDNA的R=0.780，P<0.05）。（Table3，F(xiàn)ig8，F(xiàn)ig9）。
　　 3.血清cfDNA在化療前后的變化情況
　　 化療組荷瘤裸鼠血清CA125-cfDNA及腫瘤相關cfDNA的值在化療后第1天達最高水平，第3天有下降趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義，（CA125-cfDNA的P=0.932，腫瘤相關cfDNA的P=0.068，均>0.05）。在化

10、療第10天其值明顯低于化療前水平，差異有顯著性（CA125-cfDNA的P=0.047，腫瘤相關cfDNA的P=0.013，均<0.05）。（Table3）。
　　 4.化療前后血清cfDNA水平與腫瘤細胞凋亡的關系
　　 化療前后血清CA125-cfDNA及腫瘤相關cfDNA與腫瘤細胞的凋亡率呈正相關（CA125-cfDNA101 bp片段的R=0.742，P<0.05；腫瘤相關cfDNA的R=0.693，P<0.05