經(jīng)IFNγ基因轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外抗白血病作用的研究.pdf

1、1．觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的體外生長(zhǎng)特點(diǎn)，制備供轉(zhuǎn)染用的重組腺病毒載體AdGFP和AdIFN Y。 2．觀察腺病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs生長(zhǎng)及對(duì)目的基因表達(dá)的影響，探討腺病毒載體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞合適的轉(zhuǎn)染條件。 3．觀察轉(zhuǎn)IFN-γ基因的MSCs在體外對(duì)白血病K562細(xì)胞的抗白血病作用。方法： 1．體外對(duì)凍存的：MSCs細(xì)胞株復(fù)蘇后用含10％新生小牛血清的低糖DMEM：(L-DMEM)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增及傳代

2、，每天用胰酶消化后以細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制MSCs生長(zhǎng)曲線；通過293細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)用的腺病毒載體AdGFP和AdIFN γ進(jìn)行大量擴(kuò)增和常規(guī)制備，以TCID<,50>法檢測(cè)腺病毒滴度。 2．以不同感染復(fù)數(shù)(MOI=50、100、200、500)的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs 4小時(shí)，采用MTT’法了解腺病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs增殖的影響；以綠色熒光蛋白(GFP)作為示蹤蛋白，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和檢測(cè)Ad-GFP轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間GFP

3、的表達(dá)；以ELISA法檢測(cè)Ad-IFNγ轉(zhuǎn)染MSCs后第1、8、15、22、28天細(xì)胞上清IFNγ的分泌， 并與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染Ad-GFP的MSCs作比較。 3．將K562細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因MSCs共培養(yǎng)，采用苔盼蘭計(jì)數(shù)法檢測(cè)轉(zhuǎn)IFN γ基因的MSCs對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響；以DAPI染色觀察K562細(xì)胞凋亡形態(tài)；以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因MSCs對(duì)K562細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果： 1．體外培養(yǎng)成功地?cái)U(kuò)增出了數(shù)量較多

4、的MSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示MSCs細(xì)胞在體外有良好的生長(zhǎng)特性，傳代培養(yǎng)細(xì)胞增殖迅速，在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，MSCs的倍增時(shí)間約為28-36h。 2．通過293細(xì)胞的包裝和擴(kuò)增成功制備出了大量的重組腺病毒載體：Ad-IFN Y和Ad-GFP，其滴度分別為：Ad-IFN Y 5.0×10<'8>U／ml：Ad-GFP1.0×10<'9>U／ml。 3．重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs在較低MOI值時(shí)(50和100)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影

5、響(p>0.05)；當(dāng)MOI值較高時(shí)(MOI≥200)腺病毒轉(zhuǎn)染則對(duì)MSCs的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響(p<0.05)，表現(xiàn)為經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活性降低，增殖受抑，出現(xiàn)細(xì)胞病理現(xiàn)象。 4．選擇MOI=100的AdGFP轉(zhuǎn)染MSCs，于轉(zhuǎn)染后20h即可在熒光顯微鏡下見到GFP的表達(dá)，隨著時(shí)間推移GFP表達(dá)逐漸增加，到約2周后表達(dá)可以達(dá)到32％，隨后穩(wěn)定表達(dá)。當(dāng)MOI增高后目的基因的表達(dá)可以相應(yīng)增高，但是細(xì)胞病理現(xiàn)象明顯，細(xì)胞活性降低；當(dāng)MOI=10

6、0時(shí)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs細(xì)胞周期無明顯影響(p>0.05)；含IFN-Y基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs分別可以于轉(zhuǎn)染后第1、8、15、22、28天在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到：IFN-Y的分泌，其分泌量隨著時(shí)間推移有下降趨勢(shì)；在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染AdGFP和未轉(zhuǎn)染的MSCs均不能在細(xì)胞上清中檢測(cè)到IFN-Y的分泌。 5．含IFN-Y基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染的MSCs對(duì)K562細(xì)胞的增殖有抑 制作用(p

7、-γ2000U／ml處理相似(p>0.05)；DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Ad-IFN v組及IFN-γ2000U/ml處理組凋亡細(xì)胞較未處理組增加；細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Ad-IFN γ組細(xì)胞Gl期增加，有絲分裂S期減少，凋亡細(xì)胞所占百分比增加。轉(zhuǎn)染Ad-GFP組則無此效應(yīng)。 結(jié)論： 1.在適當(dāng)?shù)臈l件下重組腺病毒載體可以有效地轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2.轉(zhuǎn)基因MSCs細(xì)胞可以較穩(wěn)定和長(zhǎng)期地表達(dá)目的基因，