基于模擬表位的玉米赤霉烯酮全抗原生物合成及其免疫學檢測性能的研究.pdf

1、真菌毒素(Mycotoxin)是一類由真菌產生的有毒次級代謝產物,大多顯示有特定的器官毒性及致癌性,是食物鏈中常見的化學性污染物之一,也是目前影響我國食品安全的主要因素。對食品中的真菌毒素進行有效地監(jiān)控和檢測是防止其危害食品安全的重要手段。真菌毒素檢測技術經過多年的研究,已經發(fā)展衍生出眾多類型的檢測模式,其中又以競爭型免疫檢測體系應用最廣。
　　 建立小分子物質免疫學檢測體系的前提和核心是全抗原的合成及抗體的制備。目前,小分子全

2、抗原的制備主要依賴于化學合成的途徑,然而該方法存在著合成步驟繁瑣、反應時間長、副產物多、批次誤差大等缺陷,特別是對于真菌毒素而言,其價格高昂且具致癌毒性,對操作人員及環(huán)境易造成毒害和污染,從而限制了免疫學檢測方法的廣泛使用。
　　 本研究以常見的真菌毒素一玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)為對象,通過噬菌體展示肽庫、外源基因表達及分子定向改造技術,實現ZEN全抗原的生物合成,并將其應用于免疫學檢測體系。主要研究內容為

3、:1)ZEN噬菌體展示抗原模擬表位(十二肽)的淘選、鑒定及其結構研究;2)ZEN噬菌體展示抗原模擬表位免疫學檢測性能的研究;3)ZEN新型模擬表位表達載體的構建、表達及其免疫學檢測性能的研究;4)ZEN抗原模擬表位構效關系的初步研究,主要研究結果如下:
　　 1、淘選獲得5種可特異性結合抗ZEN單抗(7G5)的ZEN噬菌體展示抗原模擬表位(十二肽),分別命名為Z5、Z8、Z14、Z15和Z18,采用ExPASy、Swiss-pd

4、bviewer軟件分析其理論等電點、熱穩(wěn)定指數、消光系數、平均親水性等物化性質并進行了二級結構的預測,結果表明5種模擬表位的兩端均為無規(guī)則卷曲結構,中間為螺旋結構,理論等電點均小于7.0,對熱穩(wěn)定且具有親水屬性。
　　 2、建立了基于Z5、Z8、Z14、Z15、Z18的間接競爭Phage-EIJSA標準曲線,其IC50值分別為23.5±2.0、2.6±0.4、7.0±0.8、1.2±0.3、14±1.6ng/mL。在此基礎上,將

5、ZEN抗原模擬表位進行了體外化學合成(多肽制備),并采用馬來酰亞胺法將多肽與HRP酶偶聯,建立了基于Z5-、Z8-、Z14-、Z15-、Z18-HRP偶聯物的直接競爭ELISA標準曲線,其IC50值分別為15±2.4,2.0±0.6,7.2±1.5,0.7±01,11±3.1ng/mL。
　　 3、采用SPR研究了ZEN噬菌體展示抗原模擬表位與7G5的生物相互作用及其反應動力學,并進行了結合、解離曲線的分析以及平衡解離常數KD值

6、的計算,結果顯示Z5(十二肽)、P4(七肽)與7G5均呈現良好的線性結合關系,兩者的反應動力學曲線相似,結合及解離點相近,其KD值分別為39.8,38.7nM,ZEN-BSA與7G5的KD值則為0.31nM。
　　 4、建立了基于ZEN噬菌體展示抗原模擬表位的固相膜免疫檢測方法,該方法對于谷物樣品中ZEN的Cut-off值為50μg/kg,檢測時間10min,且可肉眼判定結果;同時構建了一種PVDF膜免疫快速檢測裝置,建立了可同

7、時檢測5種真菌毒素的PVDF膜免疫檢測方法,該方法對于谷物樣品中AFB1、ZEN、DON、OTA、FB1的Cut-off值分別為20,60,1000,20,250μg/kg,檢測時間10min且可肉眼判定結果。
　　 5、構建了Z5-,Z8-,Z14-,Z15-,Z18-pMal-PⅢ和Z15-pRX-AP表達載體,經IPTG誘導后,分別獲得了Z5-,Z8-,Z14-,Z15-,Z18-MBP和Z15-AP融合蛋白,建立的間接競

8、爭ELISA標準曲線顯示均呈現典型的競爭抑制關系,其IC50值分別為1.5±0.2,1.6±0.3,3.5±0.5,7.2±0.8,1.8±0.4ng/mL。Z15-AP融合蛋白與AP底物顯色液可顯色,但與ZEN抗體的結合能力較弱,OD值在0.3-0.5之間。
　　 6、研究了ZEN抗原模擬表位的串聯拷貝數、間隔臂及環(huán)化結構與其免疫學檢測性能的關系,結果顯示串聯拷貝數、問隔臂并不是影響ZEN模擬表位免疫學檢測性能的關鍵因素;相比