2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、[目的]:
  1.利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建人類淋巴母細(xì)胞(簡(jiǎn)稱TK6細(xì)胞)的PARP-1基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞株(簡(jiǎn)稱TK6-shPARP1細(xì)胞),作為后續(xù)研究的工具細(xì)胞;
  2.闡明PARP-1/P53信號(hào)通路在氫醌(Hydroquinone,HQ)誘導(dǎo)人淋巴母細(xì)胞凋亡中的作用及其可能機(jī)制。
  [方法]:
  1.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建PARP-1基因沉默細(xì)胞株:利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法篩選出具有最佳干擾效果

2、的shRNA片段,將該片段與慢病毒載體pLVX-shRNA1連接形成重組質(zhì)粒,經(jīng)DNA測(cè)序鑒定后進(jìn)行病毒包裝,隨后轉(zhuǎn)導(dǎo)至TK6細(xì)胞中,再經(jīng)嘌呤霉素篩選而得到穩(wěn)定表達(dá)PARP-1 siRNA的PARP-1基因沉默細(xì)胞株,最后用qPCR和Western blotting鑒定所構(gòu)建的細(xì)胞株。
  2.細(xì)胞凋亡檢測(cè):利用Hoechst33342染色試劑定性觀察細(xì)胞凋亡情況;再用Caspase-3酶活性檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)Caspase-3酶

3、活性的改變情況。
  3.應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測(cè)P53信號(hào)通路相關(guān)蛋白:
  在不同濃度HQ作用于人淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞后PARP-1、SIRT-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白的表達(dá)情況;在不同濃度HQ作用于TK6-shPARP1細(xì)胞后SIRT-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白的表達(dá)情況。
  [結(jié)果]:
  1.成功構(gòu)建

4、PARP-1基因沉默細(xì)胞株:轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4細(xì)胞的PARP-1相對(duì)表達(dá)量分別為0.289、0.538、0.375和0.474,故選擇shRNA1作為干擾PARP-1基因最佳片段。用0.5μg/ml的嘌呤霉素成功篩選出PARP-1沉默細(xì)胞株和空載體對(duì)照細(xì)胞株,并從mRNA水平、蛋白質(zhì)水平、細(xì)胞表型水平三個(gè)層次來檢測(cè)PARP-1基因的干擾效率,抑制效率超過80%。
  2.HQ染毒對(duì)細(xì)胞凋亡影

5、響:Hoechst33342染色顯示在TK6正常細(xì)胞中,隨著HQ濃度的增加,凋亡小體的數(shù)量明顯增加,而在TK6-shPARP1細(xì)胞中凋亡小體的數(shù)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì);Caspase-3酶活性檢測(cè)顯示在TK6正常細(xì)胞中,隨著HQ濃度的增加,Caspase-3酶活性逐漸升高,而在TK6-shPARP1細(xì)胞中Caspase-3酶活性呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。
  3.蛋白表達(dá)水平的改變情況:
  TK6正常細(xì)胞中,隨著HQ濃度的增加,P

6、ARP-1、P53、Caspase-3、Bcl-2、Fas、K-ras蛋白表達(dá)水平逐漸升高,SIRT-1蛋白表達(dá)水平逐漸降低;TK6-shPARP1細(xì)胞中,隨著HQ濃度的增加,SIRT-1、Caspase-3、Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),P53、K-ras蛋白表達(dá)水平逐漸升高。
  [結(jié)論]:
  1.成功構(gòu)建PARP-1的siRNA慢病毒干擾載體,并篩選出PARP-1基因沉默的TK6細(xì)胞株,攜帶shR

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