3-甲基腺嘌呤對細(xì)胞自噬的雙重調(diào)節(jié)作用及NBA1調(diào)控放射誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯的初步研究.pdf

1、自噬是指細(xì)胞將一些異常聚集或錯誤折疊蛋白、損傷的細(xì)胞器等胞漿成分通過包裹并最終運送至溶酶體降解的過程，其主要功能之一是在營養(yǎng)缺乏、生長因子撤除、能量匱乏或受到應(yīng)激性的死亡威脅時，使細(xì)胞獲得對抗不利的生長環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)、實現(xiàn)更新的一種重要的自我保護性反應(yīng)機制。但當(dāng)細(xì)胞受到嚴(yán)重的不可修復(fù)的損傷，如大劑量的電離輻射輻照、某些化療藥物的作用，自噬就會轉(zhuǎn)變成為細(xì)胞的一種死亡機制。正是由于自噬在決定細(xì)胞命運中的雙重作用，有關(guān)其調(diào)控機制的研究受到極大

2、關(guān)注。目前，激活或者抑制自噬的實驗方法有自噬基因敲除、沉默、過表達及藥物處理。人類乳腺癌抑癌基因1（BRCA1）被證明與許多信號路徑和細(xì)胞進程有關(guān)，研究顯示，BRCA1敲低可增強細(xì)胞自噬，因此被認(rèn)為是一種自噬抑制劑。NBA1是2009年新確認(rèn)的BRCA1相互作用蛋白，同時也是BRCA1 A復(fù)合體成員的新組分，其敲低可導(dǎo)致BRCA1 A復(fù)合體的不穩(wěn)定。
　　本課題在研究PI3K抑制劑3-MA對電離輻射及非電離輻射后細(xì)胞存活影響的基礎(chǔ)

3、上，采用3-MA和電離輻射作用于不同輻射敏感性的HeLa細(xì)胞，觀察自噬相關(guān)蛋白表達，利用類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)構(gòu)建用于NBA1敲除的打靶質(zhì)粒對，同時利用小干擾RNA等構(gòu)建了NBA1穩(wěn)定敲低及過表達細(xì)胞模型，觀察NBA1敲低后細(xì)胞表型和DNA損傷反應(yīng)變化。目前獲得了以下主要進展：
　　1.3-MA能促進電離輻射誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，同時促進正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬；對電離輻射敏感的DNA-PKc

4、s敲低HeLa，其受4Gy照射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬明顯增強；與分割(2Gy×2)照射相比，單劑量（4Gy）照射引起的細(xì)胞自噬活性更強。
　　2.成功構(gòu)建能特異性識別并結(jié)合NBA1目標(biāo)序列的TALEN質(zhì)粒三對（T12、T34和T56），SSA法鑒定顯示T56具有更高的切割效率，進一步酶切鑒定顯示T56可以用于NBA1基因的敲除。
　　3. Western blotting和qRT-PCR結(jié)果顯示NBA1穩(wěn)定敲低和過表達的MCF-7細(xì)