饑餓環(huán)境下Lewis細(xì)胞分泌的HMGB1對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:
　　高遷移率組蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一種染色質(zhì)相關(guān)的核蛋白，也是一種炎癥因子，可參與細(xì)胞自噬進(jìn)程的調(diào)節(jié)作用。自噬是腫瘤細(xì)胞抵抗缺氧、化學(xué)藥物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等應(yīng)激條件的一種生存途徑。本研究以小鼠肺癌細(xì)胞Lewis細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討在饑餓狀態(tài)下小鼠Lewis細(xì)胞HMGB1表達(dá)及分泌情況;分析應(yīng)激條件下分泌的HMGB1對(duì)小鼠Lewis細(xì)胞自噬的調(diào)控作用以及其可能

2、依賴的分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1)饑餓處理的Lewis細(xì)胞HMGB1表達(dá)及定位的檢測(cè):HBSS替換完全培養(yǎng)液0h、3h、6h、9h后Western Blot、免疫熒光分別檢測(cè)培養(yǎng)上清及Lewis細(xì)胞中HMGB1水平的變化;將HBSS處理后的Lewis細(xì)胞進(jìn)行核漿分離，Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中HMGB1的表達(dá)水平。
　　(2)饑餓及外源性重組HMGB1處理的Lewis細(xì)胞自噬水平檢測(cè):HBS

3、S和重組HM GB1(1μg/ml)分別處理細(xì)胞后，通過(guò)免疫熒光及Western Blot測(cè)定細(xì)胞中LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1等自噬相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　(3) siRNA干擾HMGB1表達(dá)及EP抑制HMGB1分泌后細(xì)胞自噬水平的檢測(cè):用Lipofectamine2000將HMGB1特異性siRNA轉(zhuǎn)入Lewis細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，免疫熒光檢測(cè)LC3的表達(dá);EP抑制HMGB1分泌，并用HBSS處理細(xì)胞后W

4、estern Blot檢測(cè)LC3水平。
　　(4) Lewis細(xì)胞HMGB1受體的檢測(cè)及其相關(guān)分子機(jī)制的研究:HBSS處理Lewis細(xì)胞4h后PCR檢測(cè)TLR2、TLR4、RAGE的表達(dá);分別用HBSS處理細(xì)胞0h、3h、6h、9h，Western Blot檢測(cè) p-Erk1/2、NF-κB及Beclin-1的表達(dá)水平，并用RAGE特異性抗體或Erk抑制劑處理后檢測(cè)細(xì)胞自噬水平。
　　結(jié)果:
　　(1) HMGB1的表

5、達(dá)隨HBSS處理時(shí)間延長(zhǎng)而增加;HBSS處理后核漿分離的Lewis細(xì)胞核中HMGB1減少，而細(xì)胞質(zhì)中HMGB1增加，且在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到HMGB1，說(shuō)明在饑餓狀態(tài)下HMGB1有從核到胞漿的遷移，并最終分泌到細(xì)胞外。
　　(2)饑餓處理后細(xì)胞中自噬標(biāo)志性分子LC3-Ⅱ及促自噬分子Beclin-1表達(dá)增加，泛素化蛋白p62減少;重組HMGB1(1μg/ml)刺激細(xì)胞后，LC3-Ⅱ的表達(dá)增加。
　　(3) siRNA降低HMG

6、B1表達(dá)或EP抑制HMGB1分泌后，自噬相關(guān)分子LC3表達(dá)減少。
　　(4)在Lewis細(xì)胞中檢測(cè)到HMGB1受體RAGE、TLR2、TLR4的表達(dá);饑餓處理后發(fā)現(xiàn)Erk1/2磷酸化水平增加，NF-κB及Beclin-1表達(dá)水平均上升;特異性封閉RAGE或抑制Erk磷酸化后，細(xì)胞自噬水平基本沒(méi)有變化。
　　結(jié)論:
　　(1)本研究發(fā)現(xiàn)在饑餓誘導(dǎo)的應(yīng)激條件下Lewis細(xì)胞可以主動(dòng)分泌HMGB1;
　　(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果