人白細胞彈性蛋白酶抑制因子elafin的克隆、表達載體構建及對氣道黏蛋白分泌的影響.pdf

1、第一部分 人白細胞彈性蛋白酶抑制因子elafm的克隆及重組腺病毒表達載體的構建、鑒定與表達 目的：克隆人白細胞彈性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因eDNA，應用最新的腺病毒載體構建系統(tǒng)AdEasySystem構建含elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin，為進一步應用其進行氣道上皮細胞黏蛋白(MUC)分泌調(diào)控的研究打下基礎。 方法：(1)抽提人肺總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應，經(jīng)PCR擴增目的基因片段，el

2、afin目的片段經(jīng)純化雙酶切后亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，在BJ5183細菌內(nèi)和pAdEasy一1行同源重組，篩選陽性克隆，酶切、PCR及測序鑒定，PacI酶切線性化后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝，獲得腺病毒載體Ad-elafin，繼之在293細胞內(nèi)擴增，利用報告基因GFP監(jiān)測病毒滴度和感染效率，Western-blot檢測elafin蛋白的表達。 結果：(1)經(jīng)RT-PCR獲得377bp的產(chǎn)物，經(jīng)酶切、DNA

3、測序，確定所擴增片段為人elafin基因cDNA。(2)質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR鑒定證實elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin構建成功，Western-blot檢測到elafin蛋白的表達。 結論：獲得編碼elafin的基因片段，并成功構建了腺病毒表達載體Ad-elafin，為進一步研究elafin對氣道上皮細胞MUC分泌的調(diào)控奠定了技術基礎。 第二部分 Elaf'm重組腺病毒表達載體在氣道上皮細胞中

4、的表達目的研究重組腺病毒Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞的特性，觀察其在上皮細胞中的表達時相動力學規(guī)律。 方法：(1)應用原代培養(yǎng)技術培養(yǎng)人氣道上皮細胞；(2)重組腺病毒Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞；(3)在轉(zhuǎn)染后不同的時相中，采用熒光顯微鏡觀察報告基因GFP的表達，ELISA法檢測細胞上清液elafin蛋白的表達，Northem膜雜交檢測elafin基因mRNA的表達量。 結果：(1)原代培養(yǎng)人

5、氣道上皮細胞約5天，即可作為靶細胞。(2)轉(zhuǎn)染Ad-elafin24h后，熒光顯微鏡下可見上皮細胞內(nèi)有少量的GFP表達，隨著時間的延長，細胞內(nèi)熒光逐漸增加，96h后GFP熒光陽性的細胞約為80％。(3)轉(zhuǎn)染24-96h后，實驗組細胞上清液elafin的含量高于對照組(P<0．05)；同時實驗組elafin基因mRNA的表達量也高于對照組(P<0．05)。 結論重組腺病毒Ad-elafin表達載體可成功轉(zhuǎn)染人氣道上皮細胞，目的基因

6、不僅在上皮細胞中表達，而且其elafin蛋白質(zhì)具有細胞外分泌作用。 第三部分 彈性蛋白酶誘導氣道上皮細胞黏蛋白分泌作用及其信號轉(zhuǎn)導機制 目的通過彈性蛋白酶(NE)誘導氣道上皮細胞黏蛋白(MUC)分泌和MUC5ACmRNA表達，探討NE誘導氣道上皮細胞MUC的分泌特性，同時研究NE通過表皮生長因子受體(EGFR)引起黏液高分泌的上游信號通路及下游信號在MAPK亞族中的傳遞途徑。 方法：(1)應用原代培

7、養(yǎng)技術培養(yǎng)人氣道上皮細胞；(2)濃度為1um／L的NE與氣道上皮細胞孵育后在不同時相中(1、3、6、12、24、32h)，應用ELISA法檢測細胞上清液中MUC及MUC5AC；細胞有形成分抽提RNA，RT-PCR檢測MUC5ACmRNA水平；(3)不同的NE濃度(0．25、0．5、1．O、2．0、4．0um／L)與上皮細胞孵育后，同樣采用ELISA法檢測細胞上清液中MUC及MUC5AC的含量，細胞有形成分抽提RNA，應用RT-PCR檢測

8、MUC5ACmRNA表達；(4)給予NE刺激，以腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶(TNF-igconvertingenzyme，TACE)抑制劑TAPI．1及活性氧(ROS)清除劑DMTU為干預因素。RT-PCR檢測干預前后細胞中MUC5ACmRNA含量；ELISA檢測培養(yǎng)上清中MUC5AC、可溶性轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)一α蛋白含量，Westernblot檢測磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)蛋白水平。TPK信號通路中的MAPK三個亞族ERK、p

9、38MAPK及JNK各自的拮抗劑(PD98059、SB203580及SP600125)與上皮細胞孵育后，NE再進行誘導，檢測MUC5ACmRNA的表達。 結果(1)同一濃度NE與氣道上皮細胞孵育后，MUC、MUC5AC表達及MUC5ACmRNA水平在一定的時間范圍內(nèi)呈時間依賴性關系；(2)不同濃度NE與氣道上皮細胞孵育后，MUC、MUC5AC表達及MUC5ACmRNA水平在一定的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴關系；(3)NE刺激后不僅引起

10、MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平顯著高于未給予NE刺激的對照組(p＜O．01)，同時伴隨可溶性TGF-a及磷酸化EGFR蛋白水平的增高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(p

11、刺激組比較，p<0．01)，但對單純TGF-a刺激引起的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加無明顯作用，與單純TGF-a刺激組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0．05)。(4)ERK拮抗劑可有效阻斷NE誘導上皮細胞MUC5ACmRNA水平的升高；而p38MAPK及JNK的拮抗劑對NE．誘導上皮細胞MUC5ACmRNA水平影響不大。 結論(1)NE是氣道上皮細胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄及MUC、MUC5AC表達的強力誘導劑；(2)NE能刺激產(chǎn)生

12、ROS，再活化TACE引起黏蛋白產(chǎn)生增多，組成EGFR通路上游的主要信號分子，其下游信號經(jīng)MAPK中的ERK通路下傳。故ROS／TACE/pro—TGF-a／EGFR／ras／raf／MAPK／ERK轉(zhuǎn)導途經(jīng)是NE引起氣道黏液高分泌的重要機制。 第四部分 重組elafm腺病毒載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞對彈性蛋白酶誘導黏蛋白高分泌的影響 目的重組elafin腺病毒Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞后，通過

13、對彈性蛋白酶(NE)誘導的elafin基因轉(zhuǎn)錄及蛋白分泌、黏蛋白(MUC)5AC基因轉(zhuǎn)錄、蛋白分泌的觀察，探討elafin對NE誘導上皮細胞MUC高分泌的影響。 方法：(1)原代培養(yǎng)技術培養(yǎng)人氣道上皮細胞并Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞。(2)實驗組：不同濃度(O．25、0．5、1．O、2．0、4．0um／L)NE+Ad-Matin表達載體轉(zhuǎn)染的氣道上皮細胞；對照組：無NE誘導的Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染的氣道上

14、皮細胞。(3)NE刺激24h后細胞有形成分抽提RNA，RT-PCR檢測elafinmRNA及MUC5ACmRNA水平；ELISA法檢測細胞上清液中elafin及MUC5AC的含量。 結果：(1)與對照組相比較，經(jīng)與NE孵育后，elafinmRNA的表達量依NE的不同濃度分別升高為：0．25UlTI／L：184．34-58．3％、0．5um／C：3544-86．5％、1．Oum／L：5634-112．7％、2．0tlm／C：470

15、4-933％：4．0um／C為3014-76．4％。NE濃度介于0．5-4．0um／C之間時，具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)；盡管elafinmRNA水平上升，但細胞上清液中elafin卻是降低的。(2)1．OUlTI／LNE孵育Ad-elafin表達載體轉(zhuǎn)染的氣道上皮細胞，MUC5ACmRNA是對照組的56．2％，細胞上清液中MUC5AC分泌量是對照組的30．8％，具有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。 結論：(1)NE可上調(diào)重組e