人白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制因子elafin的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)氣道黏蛋白分泌的影響.pdf

1、第一部分 人白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制因子elafm的克隆及重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定與表達(dá) 目的：克隆人白細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)抑制因子elafin基因eDNA，應(yīng)用最新的腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)AdEasySystem構(gòu)建含elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin，為進(jìn)一步應(yīng)用其進(jìn)行氣道上皮細(xì)胞黏蛋白(MUC)分泌調(diào)控的研究打下基礎(chǔ)。 方法：(1)抽提人肺總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增目的基因片段，el

2、afin目的片段經(jīng)純化雙酶切后亞克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，在BJ5183細(xì)菌內(nèi)和pAdEasy一1行同源重組，篩選陽性克隆，酶切、PCR及測(cè)序鑒定，PacI酶切線性化后脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得腺病毒載體Ad-elafin，繼之在293細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，利用報(bào)告基因GFP監(jiān)測(cè)病毒滴度和感染效率，Western-blot檢測(cè)elafin蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：(1)經(jīng)RT-PCR獲得377bp的產(chǎn)物，經(jīng)酶切、DNA

3、測(cè)序，確定所擴(kuò)增片段為人elafin基因cDNA。(2)質(zhì)粒經(jīng)酶切及PCR鑒定證實(shí)elafin基因重組腺病毒載體Ad-elafin構(gòu)建成功，Western-blot檢測(cè)到elafin蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：獲得編碼elafin的基因片段，并成功構(gòu)建了腺病毒表達(dá)載體Ad-elafin，為進(jìn)一步研究elafin對(duì)氣道上皮細(xì)胞MUC分泌的調(diào)控奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。 第二部分 Elaf'm重組腺病毒表達(dá)載體在氣道上皮細(xì)胞中

4、的表達(dá)目的研究重組腺病毒Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞的特性，觀察其在上皮細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相動(dòng)力學(xué)規(guī)律。 方法：(1)應(yīng)用原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞；(2)重組腺病毒Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞；(3)在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)相中，采用熒光顯微鏡觀察報(bào)告基因GFP的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液elafin蛋白的表達(dá)，Northem膜雜交檢測(cè)elafin基因mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)人

5、氣道上皮細(xì)胞約5天，即可作為靶細(xì)胞。(2)轉(zhuǎn)染Ad-elafin24h后，熒光顯微鏡下可見上皮細(xì)胞內(nèi)有少量的GFP表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)熒光逐漸增加，96h后GFP熒光陽性的細(xì)胞約為80％。(3)轉(zhuǎn)染24-96h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液elafin的含量高于對(duì)照組(P<0．05)；同時(shí)實(shí)驗(yàn)組elafin基因mRNA的表達(dá)量也高于對(duì)照組(P<0．05)。 結(jié)論重組腺病毒Ad-elafin表達(dá)載體可成功轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞，目的基因

6、不僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)，而且其elafin蛋白質(zhì)具有細(xì)胞外分泌作用。 第三部分 彈性蛋白酶誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白分泌作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的通過彈性蛋白酶(NE)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白(MUC)分泌和MUC5ACmRNA表達(dá)，探討NE誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞MUC的分泌特性，同時(shí)研究NE通過表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)引起黏液高分泌的上游信號(hào)通路及下游信號(hào)在MAPK亞族中的傳遞途徑。 方法：(1)應(yīng)用原代培

7、養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞；(2)濃度為1um／L的NE與氣道上皮細(xì)胞孵育后在不同時(shí)相中(1、3、6、12、24、32h)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中MUC及MUC5AC；細(xì)胞有形成分抽提RNA，RT-PCR檢測(cè)MUC5ACmRNA水平；(3)不同的NE濃度(0．25、0．5、1．O、2．0、4．0um／L)與上皮細(xì)胞孵育后，同樣采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中MUC及MUC5AC的含量，細(xì)胞有形成分抽提RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)

8、MUC5ACmRNA表達(dá)；(4)給予NE刺激，以腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶(TNF-igconvertingenzyme，TACE)抑制劑TAPI．1及活性氧(ROS)清除劑DMTU為干預(yù)因素。RT-PCR檢測(cè)干預(yù)前后細(xì)胞中MUC5ACmRNA含量；ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中MUC5AC、可溶性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)一α蛋白含量，Westernblot檢測(cè)磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EGFR)蛋白水平。TPK信號(hào)通路中的MAPK三個(gè)亞族ERK、p

9、38MAPK及JNK各自的拮抗劑(PD98059、SB203580及SP600125)與上皮細(xì)胞孵育后，NE再進(jìn)行誘導(dǎo)，檢測(cè)MUC5ACmRNA的表達(dá)。 結(jié)果(1)同一濃度NE與氣道上皮細(xì)胞孵育后，MUC、MUC5AC表達(dá)及MUC5ACmRNA水平在一定的時(shí)間范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性關(guān)系；(2)不同濃度NE與氣道上皮細(xì)胞孵育后，MUC、MUC5AC表達(dá)及MUC5ACmRNA水平在一定的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系；(3)NE刺激后不僅引起

10、MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平顯著高于未給予NE刺激的對(duì)照組(p＜O．01)，同時(shí)伴隨可溶性TGF-a及磷酸化EGFR蛋白水平的增高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p

11、刺激組比較，p<0．01)，但對(duì)單純TGF-a刺激引起的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成增加無明顯作用，與單純TGF-a刺激組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0．05)。(4)ERK拮抗劑可有效阻斷NE誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MUC5ACmRNA水平的升高；而p38MAPK及JNK的拮抗劑對(duì)NE．誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MUC5ACmRNA水平影響不大。 結(jié)論(1)NE是氣道上皮細(xì)胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄及MUC、MUC5AC表達(dá)的強(qiáng)力誘導(dǎo)劑；(2)NE能刺激產(chǎn)生

12、ROS，再活化TACE引起黏蛋白產(chǎn)生增多，組成EGFR通路上游的主要信號(hào)分子，其下游信號(hào)經(jīng)MAPK中的ERK通路下傳。故ROS／TACE/pro—TGF-a／EGFR／ras／raf／MAPK／ERK轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)是NE引起氣道黏液高分泌的重要機(jī)制。 第四部分 重組elafm腺病毒載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞對(duì)彈性蛋白酶誘導(dǎo)黏蛋白高分泌的影響 目的重組elafin腺病毒Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞后，通過

13、對(duì)彈性蛋白酶(NE)誘導(dǎo)的elafin基因轉(zhuǎn)錄及蛋白分泌、黏蛋白(MUC)5AC基因轉(zhuǎn)錄、蛋白分泌的觀察，探討elafin對(duì)NE誘導(dǎo)上皮細(xì)胞MUC高分泌的影響。 方法：(1)原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞并Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染氣道上皮細(xì)胞。(2)實(shí)驗(yàn)組：不同濃度(O．25、0．5、1．O、2．0、4．0um／L)NE+Ad-Matin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的氣道上皮細(xì)胞；對(duì)照組：無NE誘導(dǎo)的Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的氣道上

14、皮細(xì)胞。(3)NE刺激24h后細(xì)胞有形成分抽提RNA，RT-PCR檢測(cè)elafinmRNA及MUC5ACmRNA水平；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中elafin及MUC5AC的含量。 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比較，經(jīng)與NE孵育后，elafinmRNA的表達(dá)量依NE的不同濃度分別升高為：0．25UlTI／L：184．34-58．3％、0．5um／C：3544-86．5％、1．Oum／L：5634-112．7％、2．0tlm／C：470

15、4-933％：4．0um／C為3014-76．4％。NE濃度介于0．5-4．0um／C之間時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；盡管elafinmRNA水平上升，但細(xì)胞上清液中elafin卻是降低的。(2)1．OUlTI／LNE孵育Ad-elafin表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的氣道上皮細(xì)胞，MUC5ACmRNA是對(duì)照組的56．2％，細(xì)胞上清液中MUC5AC分泌量是對(duì)照組的30．8％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 結(jié)論：(1)NE可上調(diào)重組e