人分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑在果蠅細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的:人分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑(secretory leukocyte protease inhibitor,SLPI)也叫抗白細(xì)胞蛋白酶(antileukoprotease,ALP)或分泌性蛋白酶抑制劑(mucous protease inhibitor,MPI),為黏膜上皮細(xì)胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白,是一種嗜中性彈性蛋白酶陽(yáng)離子抑制劑,具有抗細(xì)菌、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,H

2、IV)、抗炎癥因子和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能,對(duì)創(chuàng)傷組織的愈合也具有重要作用。近來(lái),作為一種潛在的黏膜佐劑,人SLPI在增強(qiáng)黏膜免疫方面的作用引起人們的關(guān)注,因此,我們想應(yīng)用果蠅表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式篩選出能穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞系,并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行初步鑒定,為進(jìn)一步開(kāi)展了解人SLPI在抗病毒感染及其免疫佐劑等方面的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:首先從A549細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)

3、人SLPI基因序列,設(shè)計(jì)上、下游兩個(gè)引物,并分別加入KpnⅠ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。利用PCR技術(shù),以A549的cDNA為模板擴(kuò)增SLPI的開(kāi)放讀碼框(open reading frame,ORF)。然后利用DNA重組技術(shù)將PCR基因產(chǎn)物克隆入果蠅S2細(xì)胞表達(dá)載體pMT/V5-HisA中,得到pMT-SLPI真核表達(dá)載體。應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)將pMT-SLPI與含有潮霉素B抗性基因的篩選質(zhì)粒pCoHygro以共轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞,然

4、后用含有300μg/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),每4-5d更換抗性培養(yǎng)液,大約3-4周便可產(chǎn)生抗性細(xì)胞克隆。對(duì)克隆細(xì)胞加入終濃度為500μM的CuSO4誘導(dǎo)表達(dá)48h后,收集細(xì)胞上清行Western blot檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。并利用RT-PCR的方法檢測(cè)SLPI在克隆細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間后的細(xì)胞上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)以確定誘導(dǎo)的最佳時(shí)間。誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清濃縮后行胰蛋白酶抑制實(shí)驗(yàn),以觀察果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的

5、重組蛋白是否具有良好的生物學(xué)活性。
　　結(jié)果:采用RT-PCR技術(shù)從A549細(xì)胞中得到人SLPI基因ORF,通過(guò)EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切位點(diǎn)將人SLPI基因ORF序列插入到表達(dá)載體中,成功構(gòu)建了人SLPI的真核表達(dá)載體。與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后在含有潮霉素的培養(yǎng)液中篩選3-4周,得到能穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞系,并命名為S2/SLPI。應(yīng)用CuSO4對(duì)S2/SLPI進(jìn)行誘導(dǎo)并對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清通過(guò)

6、Western blot檢測(cè),可得到大小為12kDa左右的特異性條帶,證實(shí)目的蛋白的表達(dá),并通過(guò)對(duì)不同誘導(dǎo)時(shí)間段的細(xì)胞上清行Western blot檢測(cè),確定誘導(dǎo)該蛋白的最佳時(shí)間為24h。生物學(xué)活性分析顯示人SLPI能抑制胰蛋白酶的活性。
　　結(jié)論:利用RT-PCR方法成功克隆了人SLPI基因ORF,并利用果蠅表達(dá)系統(tǒng)篩選到可分別穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞株。S2/SLPI穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立為進(jìn)一步開(kāi)展人SLPI促進(jìn)免疫