蓓薩羅丁納米混懸劑釋藥系統的構建與評價.pdf

1、肺癌是導致人類疾病的主要癌癥之一，嚴重威脅人類健康和生命，到2025年，中國將成為世界第一肺癌大國。肺癌有非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌兩大類，而肺癌中大約有85％為非小細胞癌。肺癌的治療方式和藥物選擇正日趨多樣化。其中具有高效、低毒、且具有一定靶向性的藥物，越來越成為研究熱點。
　　蓓薩羅丁(Bexarotene)為新型維甲酸類似物，其口服軟膠囊和外用凝膠劑獲FDA批準于2000年在美國上市，用于治療皮膚T-細胞淋巴瘤。

2、目前，國外正在開展蓓薩羅丁三期臨床試驗，主要用于治療非小細胞肺癌、乳腺癌及牛皮癬?；衔镙硭_羅丁對肺癌有顯著的治療效果，但是其屬于生物藥劑學分類系統(BCS)ClassⅡ類化合物，溶解性差，生物利用度低，以及給藥靶向性不好等諸多因素嚴重的限制了其臨床的應用。本課題主要以藥物蓓薩羅丁為研究重點，以期解決上述難題，并為蓓薩羅丁開發(fā)為治療肺癌新的劑型提供基礎。
　　本課題研究以蓓薩羅丁為模型藥物，采用沉淀法與高壓均質法結合(Precip

3、itation-Microfluidisation)技術將蓓薩羅丁制備成納米制劑，構建了藥物納米混懸劑給藥系統，建立了蓓薩羅丁藥物體外以及其生物樣品的分析方法，考察其制劑學特征、大鼠體內藥物動力學以及小鼠體內組織分布特征。并對納米制劑的體內外抗腫瘤活性進行考察，為肺癌靶向制劑的開發(fā)提供理論和實驗依據。本研究的主要內容包括:
　　1、蓓薩羅丁納米混懸劑處方前研究
　　根據處方前研究，利用紫外分光光度法，對蓓薩羅丁樣品進行紫外掃

4、描，確定了蓓薩羅丁藥物最適宜的檢測波長，建立了藥物的高效液相測定方法，方法學考察結果表明，蓓薩羅丁在濃度范圍0.05～40.0ug·mL-1線性關系良好含量測定方法的日內、間精密度、穩(wěn)定性、重現性以及回收率均符合方法學考察的要求。
　　2、蓓薩羅丁納米混懸劑的工藝研究與處方優(yōu)化
　　采用正交設計法蓓薩羅丁納米混懸劑進行處方優(yōu)化篩選，以輔料的用量為考察因素，以不同穩(wěn)定劑對納米混懸劑Zeta-電位的影響作為篩選指標。實驗結果顯示

5、，各因素對Zeta-電位的影響大小順序依次為:卵磷脂＞PluronicF68＞PVPK30。制備得到納米混懸劑屬于熱力學不穩(wěn)定系統，為提高納米混懸劑的穩(wěn)定性，采用冷凍干燥法將其制備成了凍干粉。在凍干過程中，為保證蓓薩羅丁納米混懸劑良好的分散性和物理化學穩(wěn)定性，對其凍干工藝進行考察。通過對蓓薩羅丁納米混懸劑共晶點的測定和凍干保護劑的篩選，確定冷凍干燥工藝為:采用沉淀法進行預處理，同時結合高壓均質技術制備蓓薩羅丁納米混懸劑，加入5％甘露醇作

6、為凍干保護劑，置冷凍干燥機中，凍干24h，得到納米混懸劑凍干粉(NC-Bexarotene)。
　　3、蓓薩羅丁納米混懸劑制劑學性質的研究
　　經過凍干工藝制備得到蓓薩羅丁納米混懸劑之后，對其進行制劑學性質的考察。采用DelsaTMNanoCParticleAnalyzer測得NC-Bexarotene的粒徑及Zeta-電位;對蓓薩羅納米混懸劑進行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，從納米混懸劑NC-Bexarotene放大倍數為

7、5，000和10，000的圖像中可以看出，納米混懸劑粒度分布較均勻，且外觀呈不規(guī)則的顆粒狀;透射電鏡(TEM)觀察結果表明蓓薩羅丁納米混懸劑基本上呈完整球形外觀，且粒度分布均一;從NC-Bexarotene原子力顯微鏡(AFM)分析的3D表面形態(tài)圖像中可以看出，納米制劑在水中復溶后并沒有出現聚集的現象，說明制劑凍干之后是穩(wěn)定的。
　　將藥物與輔料處方比例的物理混合物，NC-Bexarotene樣品和三個月后的NC-Bexarote

8、ne進行差示掃描量熱分析(DSC)，X-射線衍射(XRPD)測定和共聚焦顯微拉曼光譜檢測。DSC曲線中可以看到各樣品中的蓓薩羅丁有相同的吸熱峰;蓓薩羅丁的特征峰均可以在X-射線衍射(XRPD)的衍射圖譜中找到;在拉曼譜圖中，我們可以看到1607cm-1的峰顯示的是蓓薩羅丁的C=C。根據DSC，XRPD和拉曼譜圖，可以充分的表明在以沉淀法-高壓均質法制備制劑以及冷凍干燥的過程中蓓薩羅丁的晶型并沒有發(fā)生改變，體現出了良好的物理化學穩(wěn)定性。<

9、br>　　用恒溫電磁攪拌法對NC-Bexarotene的飽和溶解度進行考察，實驗結果表明其PBS(pH=7.4)中溶解度顯著提高。體外溶出采用槳法進行測定，結果表明與原料藥相比，納米制劑很大程度的改善了蓓薩羅丁的溶出速率。實驗中為了對照納米制劑和已上市軟膠囊藥物（SoftGelatinCapsule，SGC)的體外釋放情況，采用透析的方法進行比較，納米制劑和已上市軟膠囊藥物的體外釋放實驗結果表明，納米制劑的釋放速度比SGC有明顯的優(yōu)越性

10、。NS-Bexarotene和NC-Bexarotene的初步穩(wěn)定考察以外觀，粒徑以及分布為指標，結果證明了將NS-Bexarotene制備成NC-Bexarotene顯著的增加了制劑的穩(wěn)定性。
　　4、蓓薩羅丁納米混懸劑在大鼠體內的藥代動力學研究
　　本文建立了蓓薩羅丁生物樣品的HPLC檢測方法，考察了NC-Bexarotene分別經口服給藥和靜脈注射給藥后在大鼠體內的藥物動力學過程，探討了納米制劑在改善藥物動力學特征方面

11、所起到的作用。
　　分別研究了經灌胃給藥以及靜脈內給藥后藥物在大鼠體內的藥代動力學行為，根據口服藥動學參數具體分析，蓓薩羅丁原料藥對照組和納米混懸劑NC-Bexarotene組口服給藥均符合二室模型。根據藥動學參數分析，NC-Bexarotene制劑組的半衰期Ｔ1/2明顯長于溶液組;而NC-Bexarotene混懸劑組AUC0-∞為接近溶液組的2倍，納米釋藥系統維持相對持久且平穩(wěn)的藥-時曲線，主要由于其具有良好的生物黏附性的特點，

12、延長了藥物在胃腸道的滯留時間，很大程度提高了藥物生物利用度。而經靜脈注射后，藥物能夠迅速進入到血液循環(huán)，NC-Bexarotene以注射用水為溶劑，避免了有機溶劑對機體的刺激和損害，比起蓓薩羅丁溶液組有更好的順應性。
　　5、納米混懸劑在小鼠體內組織分布的研究
　　為了考察納米制劑對藥物體內分布特征的改變，該實驗研究了NC-蓓薩羅丁制劑在小鼠體內組織分布的特征。對口服后藥物在血漿的動力學過程進行分析，與Bexarotene-

13、Sol相比，NC-Bexarotene明顯的降低了藥物的初始濃度，并且使藥-時曲線更加平穩(wěn)且持久。MRT從3.82h增加到了16.58h，AUC從17.02h·ug·g-1增加到103.2h·ug·g-1;而注射組的MRT變化卻不大，但AUC由12.68h.ug.g-1提高到了18.65h·ug·g-1。與Bexarotene-Sol相比，不論通過口服給藥還是經靜脈注射給藥，NC-Bexarotene均可降低心臟以及腎臟中最高藥物濃度，

14、可以避免過高的藥物濃度對心臟以及腎臟機能產生不良影響。由于NC-Bexarotene明顯延長了藥物在體內的滯留時間，Bexarotene在心臟中的MRT也由1.96h增加到3.15h（口服)，1.73h增加到2.90h（注射)，但在心臟中的分布百分率與溶液相比卻大大降低。根據肝臟組織分布結果，口服過程中，NC-Bexarotene在肝臟中的MRT雖也有所延長，但藥物AUC變化并不明顯，而且分布百分比也并不突出;注射組中，MRT略有延長，

15、AUC相對于Bex-Bexarotene有一定的提高，分布百分率也增加?？诜约白⑸銷C-Bexarotene之后，藥物在脾中的分布均較溶液組有明顯的提高，藥物在脾中的AUC、AUQ值明顯增大，MRT值也明顯的延長，Ce為1.50（口服組)和1.25（注射組)均較肝臟的靶向性明顯，但從藥物的分布百分比圖中可看出腎臟中藥物百分比明顯低于其他臟器。在肺組織分布中，藥物在肺中的分布情況幾乎與脾中的分布情況相似。不論是AUC、AUQ還是MRT均

16、得到增加，口服中AUC由48.25增加到79.93，MRT由1.96延長到3.80;注射組中，AUC由32.85增加到54.94，MRT由2.69延長至6.34。，rCe為1.7（肺＞脾＞肝)。而且根據相對分布百分比率圖比較，相比于溶液組有明顯的提高。與溶液組相比，NC-Bexarotene幾乎在各時間點的腎臟濃度均有明顯的降低，因此將蓓薩羅丁制備成NC-Bexarotene后有利于降低Bexarotene可能帶來的腎臟毒性。
　

17、　6、蓓薩羅丁納米混懸劑對人肺腺癌細胞A549及其裸鼠移植瘤的藥效學考察
　　從細胞學實驗和在體裸鼠移植瘤實驗結果表明，蓓薩羅丁和蓓薩羅丁納米混懸劑可抑制人體肺腺癌上皮A549細胞系增殖，蓓薩羅丁納米混懸劑作用相對較強;蓓薩羅丁納米混懸劑顯著誘導人肺腺癌上皮A549細胞的凋亡，細胞周期的G1期阻滯;通過細胞滲漏乳酸脫氫酶(LDH)含量測定證實蓓薩羅丁和蓓薩羅丁納米混懸劑對人體肺腺癌上皮A549細胞沒有明顯的毒性作用;在給藥期間，荷

18、瘤模型組裸鼠的體重下降更明顯，蓓薩羅丁納米混懸劑組裸鼠死亡率最低;在給藥期間，蓓薩羅丁和蓓薩羅丁納米混懸劑可以抑制裸鼠移植瘤瘤體積的增長，但與荷瘤模型組比較作用不顯著;給藥第13天和第17天之后，蓓薩羅丁納米混懸劑組可明顯抑制裸鼠移植瘤相對體積RTV;解剖后離體的裸鼠移植瘤體積和重量，蓓薩羅丁納米混懸劑組最低，但各組間無顯著性差異。從在體實驗結果看，要達到更有效的治療效果，還需要延長給藥時間，但可能由于人肺腺癌上皮A549細胞的侵襲性比

19、較強，給藥后期裸鼠死亡的比例加大，裸鼠的體重偏低，特別是荷瘤模型組的裸鼠。相對蓓薩羅丁，蓓薩羅丁納米混懸劑有更好的抑制人體肺腺癌上皮A549細胞增殖、誘導凋亡、引起細胞周期阻滯的作用，荷瘤鼠死亡率低，無明顯的毒副作用。
　　本課題首次構建了蓓薩羅丁納米混懸劑釋藥系統，首次對蓓薩羅丁納米混懸劑的口服以及注射制劑在動物體內的藥物動力學，組織分布特征進行了評價，并首次對蓓薩羅丁納米混懸劑對人肺腺癌細胞A549及其裸鼠移植瘤的藥效學進行考