MD-2在人角膜上皮細(xì)胞應(yīng)答LPS刺激中的作用研究.pdf

1、細(xì)菌性角膜炎(bacterial keratitis)是指由細(xì)菌感染引起的角膜化膿性炎癥，至今仍是世界性的常見致盲眼病。在許多國家和地區(qū)，銅綠假單胞菌是首位的細(xì)菌性角膜炎致病菌，銅綠假單胞菌屬于革蘭氏陰性的條件致病菌，該菌可以產(chǎn)生多種致病因子，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其最主要的致病因子，LPS通過誘導(dǎo)角膜細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等，發(fā)揮關(guān)鍵的致炎作用。哺乳動物細(xì)胞對LP

2、S刺激產(chǎn)生應(yīng)答，需要通過一系列蛋白輔助，其中產(chǎn)生應(yīng)答的起始為LPS受體復(fù)合物。目前認(rèn)為LPS受體復(fù)合物至少包括四個組成部分：LPS結(jié)合蛋白(LPS binding protein，LBP)、CD14、髓樣分化蛋白2(myeloid differention-2，MD-2)以及Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)。MD-2分子的發(fā)現(xiàn)是近些年來LPS受體復(fù)合物研究方面最重要的進(jìn)展之一，MD-2關(guān)聯(lián)LPS與TL

3、R4，為LPS/TLR4信號途徑提供必需的橋接。然而，人角膜上皮細(xì)胞對LPS刺激是否發(fā)生應(yīng)答，可能與人角膜上皮細(xì)胞MD-2的表達(dá)與否，以及TLR4的分布位置有關(guān)。
　　 目的：本課題以人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1(spontaneously derived humancorneal epithelial cell line1，SDHCEC1)作為實驗對象，體外探討人角膜上皮細(xì)胞對LPS的刺激應(yīng)答機(jī)制。
　　 方法：傳代培

4、養(yǎng)來源于中山大學(xué)眼科中心王智崇教授團(tuán)隊連續(xù)培養(yǎng)成功的人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化法鑒定角膜上皮細(xì)胞的特異蛋白CK3/CK12的表達(dá)。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細(xì)胞不同時間后，Real-time PCR檢測TLR4、CD14、IL-8和MD-2 mRNA；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8；Western Blot檢測IκB-α和p-IκB-α的活化；流式細(xì)胞術(shù)檢測SDHCEC1細(xì)胞膜表面和細(xì)胞

5、內(nèi)TLR4、CD14的表達(dá)。構(gòu)建MD-2克隆質(zhì)粒并鑒定，構(gòu)建重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒并鑒定。重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western Blot檢測重組MD-2表達(dá)。將293T細(xì)胞分泌的重組MD-2蛋白加入SDHCEC1細(xì)胞培養(yǎng)基中，Real-time PCR檢測TLR4、CD14和IL-8；流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4、CD14；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8；Western Blot檢測IκB-α和p-IκB-α。
　　

6、結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下，SDHCEC1細(xì)胞呈典型角膜上皮細(xì)胞形態(tài)；SDHCEC1細(xì)胞內(nèi)CK3/CK12陽性表達(dá)。不同濃度的LPS刺激SDHCEC1細(xì)胞不同時間長度后，Real-time PCR結(jié)果顯示TLR4、CD14弱陽性表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異，IL-8和MD-2則未見表達(dá)；ELISA檢測培養(yǎng)基無IL-8的分泌；Western Blot檢測未見活化的p-IκB-α；流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)SDHCEC1細(xì)胞膜表面未見TLR4、CD14表達(dá)，而細(xì)胞質(zhì)

7、中TLR4、CD14弱陽性表達(dá)。MD-2克隆質(zhì)粒和重組MD-2表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。MD-2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，Western Blot檢測重組MD-2蛋白表達(dá)。與正常細(xì)胞相比較，添加重組MD-2蛋白培養(yǎng)的SDHCEC1細(xì)胞對LPS產(chǎn)生應(yīng)答，表現(xiàn)為：Real-time PCR檢測TLR4、CD14和IL-8 mRNA表達(dá)上調(diào)；流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4、CD14在細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)均陽性表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)基IL-8含量增高；We

8、stern Blot檢測到NF-κB的活化。
　　 結(jié)論：人角膜上皮細(xì)胞SDHCEC1 MD-2表達(dá)缺失，細(xì)胞膜表面缺乏功能性的TLR4表達(dá)，LPS/TLR4/MD-2信號途徑中，NF-κB不活化，細(xì)胞未見分泌促炎細(xì)胞因子IL-8，這可能是在正常情況下，人角膜上皮細(xì)胞通過調(diào)控MD-2與細(xì)胞膜表面的TLR4表達(dá)，抑制對LPS刺激的先天免疫反應(yīng)，避免炎癥細(xì)胞在角膜中聚集和角膜結(jié)構(gòu)被炎癥破壞，維持角膜局部的免疫自穩(wěn)狀態(tài)。但當(dāng)出現(xiàn)外源性