SB216763和肝復(fù)康干預(yù)下的肝星狀細胞中Wnt-β-catenin與Wnt-Ca2+信號通路之間的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　肝纖維化是多種慢性肝臟病變最終進展到肝硬化的一個重要中間過程，以肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和細胞外基質(zhì)(extracel lular matrix，ECM)的大量沉積為主要特征。研究證實，Wnt信號通路在肝纖維化的過程當(dāng)中起到了重要的作用，其中以Wnt/β-catenin研究的最多。中藥肝復(fù)康是我校病理生理教研室經(jīng)多年實驗總結(jié)出的抗肝纖維化的經(jīng)驗方，已證實對Wnt/β-cat

2、enin通路和非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號通路均有抑制作用。目前，在對腫瘤一些的研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt/Ca2+信號通路能夠?qū)nt/β-catenin通路起到抑制的作用，即說明了這兩條通路在有些腫瘤中并不是單一的產(chǎn)生作用，而兩條通路之間也是可能存在某種相互關(guān)系，能夠相互影響，但在對肝纖維化的研究中則主要研究的是每條通路與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展可能存在的某些機制，但對這兩條通路之間的相互關(guān)系卻還不十分明確。SB216763是GSK-3β的抑制劑

3、，使胞漿中β-catenin大量累積并入核，從而激活Wnt/β-catenin通路。本實驗通過使用中藥肝復(fù)康藥物血清和SB216763干預(yù)培養(yǎng)的HSC，然后分析在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中Wnt/β-catenin通路與Wnt/Ca2+信號通路之間的相互關(guān)系。
　　方法:
　　用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5％CO2混合氣體、37℃的孵箱中培養(yǎng)，傳代大鼠HSC-T6細胞株。待細胞條件成熟后，再用不含血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓

4、培養(yǎng)24h后分組加藥。
　　在六孔板中將細胞隨機的分為以下五組:正常血清組（含10％正常大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676320μM組（含10％正常大鼠血清，SB2167632umol/L的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676310μM組（含10％正常大鼠血清，SB2167631umol/L的DMEM培養(yǎng)基）:肝復(fù)康治療組（含10％肝復(fù)康治療組大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基）;SB21676320μM加肝復(fù)康治療組（SB216763

5、20μM基礎(chǔ)上用10％肝復(fù)康藥物血清干預(yù)），用孵箱在37℃，5％CO2混合氣體的環(huán)境中培養(yǎng)48h。
　　逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測HSC細胞中collagenⅠ，collagenⅢ，a-SMA的表達和Wnt/Ca2+信號通路中的相關(guān)指標(biāo)Wnt5a， Frizzled2，CAMKⅡ，MPP-7 mRNA相對表達量，免疫蛋白

6、印跡法(western blot)檢測細胞中MPP-7的蛋白表達量。實驗結(jié)果均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。
　　結(jié)果:
　　1、SB216763與肝復(fù)康對大鼠HSC-T6細胞活性及a-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響
　　1.1 RT-PCR檢測SB216763對大鼠HSC-T6細胞活性及a-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原的影響
　　SB21676310μM與SB21676320μM組HSC明顯活化，Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原

7、、a-SMA表達量與正常血清組相比顯著增加，其中又以SB21676320μM組增多的更為明顯，說明使用SB216763后HSC-T6細胞株有明顯的纖維化傾向。
　　1.2 RT-PCR檢測肝復(fù)康對HSC-T6中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA表達的影響
　　肝復(fù)康藥物血清組與SB21676310μM、SB21676320μM組相比，HSC細胞中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA的表達量顯著減少，同時SB21676320μM加肝復(fù)康

8、血清組與SB21676320μM組相比，三者的表達量均有所減少，說明肝復(fù)康能夠有效的抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、a-SMA在HSC-T6細胞株中的表達。
　　2、SB216763和肝復(fù)康對HSC-T6細胞株中Wnt/Ca2+信號通路相關(guān)指標(biāo)表達的影響
　　2.1 RT-PCR檢測Wnt/Ca2+信號通路中Wnt5a的mRNA表達
　　Wnt5a是Wnt/Ca2+信號通路是一種重要的起始蛋白，在正常大鼠肝臟細胞中含量很少，幾

9、乎不表達。雖然Wnt與不同的受體結(jié)合后，能夠激活不同的Wnt通路，包括經(jīng)典Wnt通路，但在本實驗中，Wnt經(jīng)典通路激活后，通過RT-PCR顯示，各組Wnt5a的mRNA相對表達量與對照組相比無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.2 RT-PCR檢測Wnt/Ca2+信號通路中Frizzed2的mRNA表達
　　Frizzed2是Wnt信號通路的中一種跨膜受體蛋白， Wnt5a與其結(jié)合后激活Wnt/Ca2+信號通路，在正常大鼠肝臟

10、細胞中表達很少，幾乎不表達。通路RT-PCR測其在SB21676320μM、10μM、肝復(fù)康藥物血清治療組、肝復(fù)康加SB216763的mRNA相對表達量與正常血清對照組相比無明顯變化。
　　2.3 RT-PCR檢測Wnt/Ca2+信號通路中CAMKⅡ的mRNA表達
　　CAMKⅡ是Wnt/Ca2+信號途徑下游一種關(guān)鍵的蛋白激酶，在正常大鼠肝臟細胞表達微量，幾乎不表達。通過RT-PCR檢測CAMKⅡ在各組的mRNA相對表達量，

11、發(fā)現(xiàn)與正常血清對照組相比沒有表達差異，無統(tǒng)計差異性，說明在使用SB216763后，Wnt/Ca2+信號途徑可能沒有受到Wnt/β-Catenin信號通路的影響而發(fā)生相應(yīng)的改變。
　　2.4 RT-PCR檢測Wnt/Ca2+信號通路MMP-7的mRNA表達
　　MMP-7在正常大鼠肝臟細胞中表達很少，幾乎不表達。在RT-PCR檢測結(jié)果中，雖然與正常血清對照組相比，SB21676320μM組中的mRAN表達相對量增加，但是差異沒

12、有有顯著性。在其它三組SB21676310μM、肝復(fù)康藥物血清組及肝復(fù)康加SB21676320μM中的mRNA相對表達量均無明顯變化。
　　3 Western-blot檢測實驗結(jié)果
　　MPP-7在正常肝臟組織細胞很少表達，幾乎不表達。與正常血清組相比SB21676320μM增多較為明顯，10μM及肝復(fù)康、肝復(fù)康加SB216763組表達則無明顯差別，且表達均不明顯，與RT-PCR的實驗結(jié)果一致，這可能與其復(fù)雜的表達調(diào)控有關(guān)。