玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性組分的制備及相關(guān)基因克隆研究.pdf

1、玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是一種分離自馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中的重要生防菌，對(duì)黃瓜白粉病、棉花黃萎病等多種重要植物病害均有良好的防治效果。本文對(duì)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的生物活性組分及其相關(guān)基因進(jìn)行了研究。 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63在燕麥液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，每1000ml發(fā)酵液可提純獲得172.2mg粗提抗生素，采用牛津杯法活性檢測(cè)表明對(duì)棉花黃萎病菌、馬鈴薯瘡痂病菌抑菌活性

2、穩(wěn)定。定量測(cè)定表明馬鈴薯瘡痂病菌最敏感，0.3mg/ml粗提抗生素即可完全抑制其生長(zhǎng)；粗提抗生素對(duì)變鉛青鏈霉菌(TK24和TK54)的抑菌活性較低。薄層分析表明甲醇：氯仿為1：6時(shí)是粗提抗生素薄層層析的最佳展開(kāi)條件，可分離出7個(gè)組分，其中組分Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌具有抑菌活性，組分Ⅶ還對(duì)棉花黃萎病菌有抑菌活性?？股亟M分Ⅲ對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌的抑菌活性最強(qiáng)。采用制備型薄層硅膠板對(duì)抗生素組分Ⅲ進(jìn)行了大量制備，TLC和HPLC分析表明薄層分

3、離制備的抗生素組分Ⅲ純度較高，紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)為198.1nm和274.5nm，與先前用HPLC制備的組分13近似。 玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63對(duì)自身抗生素組分Ⅲ具有較高的耐受性，因而其基因組中有相應(yīng)的抗性基因。采用鳥(niǎo)槍法基因克隆技術(shù)在變鉛青鏈霉菌中克隆了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63抗生素組分Ⅲ的抗性基因，定位于1.7kb基因片段上，該基因片段有4個(gè)ORFs，ORF1編碼386aa，與灰色鏈霉菌和天

4、藍(lán)色鏈霉菌的β-半乳糖苷酶高度同源；ORF2編碼83aa，與除蟲(chóng)鏈霉菌MA-4680、天藍(lán)色鏈霉菌、山丘鏈霉菌核糖體大亞基L2蛋白R(shí)NA結(jié)合域以及南昌鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌的葡聚糖內(nèi)切酶高度同源，可能是鏈霉菌尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。ORF3編碼氨基酸與動(dòng)球菌(KineococcusradiotoleransSRS30216)的醛/酮還原酶一致性和相似性均為66﹪。在ORF3相應(yīng)位置的互補(bǔ)鏈上(1697-1352bp)存在一個(gè)ORF4，編碼115a

5、a，與除蟲(chóng)鏈霉菌的分泌蛋白(multidrugresistanceprotein，SpcT-likeeffluxprotein，450aa)有較低的同源性，這一編碼區(qū)應(yīng)進(jìn)一步亞克隆研究其功能。 采用鳥(niǎo)槍法以質(zhì)粒pIJ702為載體在鏈霉菌常用宿主菌中建立了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63合成相關(guān)基因克隆文庫(kù)，以馬鈴薯瘡痂病菌為指示菌從6000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到3個(gè)具有抑菌活性的轉(zhuǎn)化子，其中SA-3對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌抑菌活性最強(qiáng)

6、。質(zhì)粒提取及酶切分析表明，轉(zhuǎn)化子SA-3質(zhì)粒pSA3外源插入片段8.5kb左右，功能驗(yàn)證表明pSA3轉(zhuǎn)化變鉛青鏈霉菌TK54對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌具有明顯抑菌活性，而對(duì)棉花黃萎病菌無(wú)抑菌活性；發(fā)酵試驗(yàn)表明其發(fā)酵液為紫紅色，經(jīng)乙酸乙酯萃取可獲得對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌的抑菌活性組分，HPLC分析顯示變鉛青鏈霉菌(pSA3)發(fā)酵液粗提純產(chǎn)物色譜圖有6個(gè)吸收峰，而變鉛青鏈霉菌(pIJ702)發(fā)酵粗提純產(chǎn)物的色譜圖有5個(gè)吸收峰。對(duì)pSA3外源片段進(jìn)行了亞克隆

7、測(cè)序，用Frameplot對(duì)基因序列進(jìn)行ORF分析表明外源片段中有10個(gè)完整讀碼框和2個(gè)不完整讀碼框，其中2個(gè)ORF分別與鏈霉菌的whiB族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋、DNA/RNA解旋酶同源，并含有死盒解旋酶超家族(DEXDc，DEAD-likehelicasessuperfamily)結(jié)構(gòu)域，還有1個(gè)ORF含有HTHXRE(Helix-turn-helix，xenobioticresponseelementfamilyoftranscription