CIC3在碘離子致臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡中的作用.pdf

1、目的：
　　 碘離子可以致內(nèi)皮細胞等多種細胞增殖和凋亡，而經(jīng)典的碘離子通道就是分布在甲狀腺上的鈉-碘同向轉運體(NIS)，NIS主要在甲狀腺及神經(jīng)組織等腺外組織表達，而內(nèi)皮細胞上是否也有NIS表達至今未見報導。但是，內(nèi)皮細胞上卻有氯離子通道-3(CLC3)的表達，并且CLC3在通常情況下對碘離子的選擇性大于氯離子。由此，本實驗通過體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞，運用RT-PCR、Western Blot、流式細胞術等方法研究CLC3通道

2、在不同碘離子濃度及時相促進臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡中的作用，探討碘離子是否經(jīng)過CLC3進入內(nèi)皮細胞，豐富碘離子通道的研究。
　　 方法：
　　 1．細胞株：人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)細胞株，購于南京凱基生物有限公司
　　 2．實驗分組：KI
　　 3．流式細胞術：用不同濃度的碘離子培養(yǎng)液處理臍靜脈內(nèi)皮細胞24小時和48小時后，經(jīng)離心-PBS沖洗—吹勻—固定—再離心—沖洗—吹打—染色（4℃，20~30分鐘）

3、后，再用400目尼龍網(wǎng)將之過濾之后上機檢測。用ModFit分析軟件分析，細胞相對增殖活力用細胞分裂增殖指數(shù)表示。
　　 4．鈉碘同向轉運體(NIS)mRNA的RT-PCR:將臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于含不同濃度的碘離子培養(yǎng)液中24小時和48小時后，提取細胞的總RNA，經(jīng)反轉錄—擴增—電泳，檢測鈉碘同向轉運體(NIS)mRNA的表達。
　　 5．鈉碘同向轉運體(NIS)蛋白Western Blot:用不同濃度的碘離子培養(yǎng)液培養(yǎng)臍

4、靜脈內(nèi)皮細胞24小時和48小時后，提取總蛋白，經(jīng)電泳—轉膜—封閉—孵育—抗—孵育二抗—顯色等過程，檢測目的蛋白NIS的表達。
　　 6．氯離子通道(CLC3)mRNA的RT-PCR:將臍靜脈內(nèi)皮細胞用含不同濃度的碘離子培養(yǎng)液處理24小時和48小時后，提取其總RNA，再經(jīng)反轉錄—擴增—電泳等步驟，檢測氯離子通道(CLC3)mRNA的表達。
　　 7．氯離子通道(CLCN3)蛋白的Western Blot:搜集含不同濃度碘離

5、子培養(yǎng)液處理24小時和48小時后的臍靜脈內(nèi)皮細胞，先用蛋白裂解液提取總蛋白，再經(jīng)電泳—轉膜—封閉—孵育一抗—孵育二抗—顯色，檢測目的蛋白CLCN3的表達。
　　 結果：
　　 1．流式細胞術：24小時，碘離子濃度為100μg/L~5000μg/L實驗組細胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，而細胞凋亡率明顯低于對照組；碘離子濃度為7000μg/L的實驗組細胞增殖指數(shù)與對照組比較沒有明顯差別，而細胞凋亡率明顯高于對照組；碘離子濃度≥9

6、000μg/L的實驗組細胞增殖指數(shù)明顯低于對照組，而細胞凋亡率高于對照組。48小時，碘離子濃度為100μg/L~3000μg/L實驗組細胞增殖指數(shù)明顯高于對照組，同時細胞凋亡率明顯低于對照組；碘離子濃度為5000μg/L的實驗組細胞增殖指數(shù)跟對照組比較沒有差別，而細胞凋亡率高于對照組；碘離子濃度≥7000μg/L的實驗組細胞增殖指數(shù)低于對照組，同時細胞凋亡率明顯高于對照組。
　　 2．鈉碘同向轉運體(NIS)mRNART-PCR

7、:鈉碘同向轉運體(NIS)mRNA在HUVEC表達缺失。
　　 3．鈉碘同向轉運體(NIS)蛋白western:鈉碘同向轉運體(NIS)蛋白在HUVEC表達缺失。
　　 4．氯離子通道(CLC3)mRNART-PCR:與對照組相比，24h時1000μg/L～5000μg/L實驗組，和48h時1000μg/L實驗組CLC3的mRNA表達上調(diào)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；7000μg/L實驗組(24h)和5000μg/L

8、實驗組(48h)CLC3的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；9000μg/L實驗組在24h時及7000μg/L～9000μg/L實驗組在48h時CLC3的mRNA表達下調(diào)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 5．氯離子通道(CLCN3)蛋白western blot:與對照組相比，1000～5000μg/L實驗組(24h)及1000μg/L實驗組(48h)在細胞CLCN3蛋白表達增強，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；

9、而7000μg/L實驗組(24h)及5000μg/L實驗組(48h)CLCN3蛋白表達與對照組沒有差別，無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；9000μg/L實驗組(24h)及7000μg/L～9000μg/L(48h)CLCN3蛋白表達減弱，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1．碘離子對臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖活性具有促進和抑制兩方面的作用，其作用效果與作用時間和作用濃度密切相關，即適宜濃度的碘離子對臍靜脈內(nèi)皮細胞