土槿皮乙酸抑制胃癌體內(nèi)生長及通過Cox-2-PKC-α-P-gp通路逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥.pdf

1、目的
　　化學治療是胃癌治療的重要手段，但多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)導致的治療效果降低成為胃癌治療的主要難點。研究發(fā)現(xiàn)，介導多藥耐藥的主要機制與P-gp表達過多有關(guān)。在腫瘤的多藥耐藥細胞中，環(huán)氧合酶-2(Cox-2)和蛋白激酶C(PKC)的亞型PKC-α的表達也有所增加。
　　土槿皮乙酸(PseudolaricacidB，PAB)是松科植物金錢松的近根樹皮或根皮中提取出來的一種二萜類酸，具有誘

2、導多種腫瘤細胞生長抑制、細胞周期阻滯及細胞凋亡的活性，而且能逆轉(zhuǎn)肝癌QGY-TR50細胞株的多藥耐藥。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，PAB對人胃腺癌SGC7901細胞系及SGC7901/ADR細胞系具有明顯的體外抑制作用。但目前對于PAB的體內(nèi)抗腫瘤療效研究較少，而且其抑制腫瘤多藥耐藥的機制尚不清楚。本研究將探討PAB對胃癌裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用及其逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的分子機制。
　　方法
　　1、細胞培養(yǎng)
　　常規(guī)培養(yǎng)人胃

3、癌SGC7901細胞及人胃癌多藥耐藥SGC7901/ADR細胞，SGC7901/ADR細胞的培養(yǎng)基中加入1μg/ml阿霉素(ADR)維持其耐藥性。
　　2、人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立
　　將50只裸鼠隨機分為兩組，每組25只，分別于裸鼠腋下接種兩種細胞的單細胞懸液，建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，每組再隨機分為生理鹽水對照組、吐溫對照組、阿霉素組、土墐皮乙酸組及阿霉素和土墐皮乙酸聯(lián)合給藥組5個亞組，每亞組5只裸鼠，每天一次分

4、別腹腔給予相應的藥物注射治療，連續(xù)給藥20天。
　　3、人胃癌裸鼠皮下移植瘤體積和重量的測量與計算
　　每日測量裸鼠體重，隔日觀察移植瘤并用游標卡尺測量瘤體的長徑、短徑。分別計算各組中每只裸鼠的腫瘤體積、相對腫瘤體積、相對體重及藥物的平均抑瘤率。PAB和(或)ADR的治療效果通過移植瘤的大小和重量評價，以裸鼠體重變化評價藥物對裸鼠體重的影響。
　　4、免疫組織化學法檢測Cox-2、PKC-α及P-gp的表達
　　

5、分別取各組腫瘤組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片，以免疫組化SP法方法檢測Cox-2、PKC-α及P-gp的表達，顯微鏡下觀察染色的效果，顯微鏡下(×400)攝片。
　　5、Westernblot法檢測Cox-2、PKC-α及P-gp的表達
　　分別提取生理鹽水對照組、吐溫對照組、阿霉素組、土墐皮乙酸組及阿霉素和土墐皮乙酸聯(lián)合給藥組腫瘤組織的蛋白，以Westernblot法檢測Cox-2、PKC-α及P-gp的表達。<

6、br>　　6、統(tǒng)計學處理
　　本實驗所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，利用SPSS17.0分析軟件，采用ANOVE方差分析法中SNK和LSD法進行差異性分析，P＜0.05提示有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果
　　1、土墐皮乙酸對胃癌裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用
　　裸鼠體內(nèi)實驗表明，對于SGC7901細胞移植瘤，各治療組腫瘤體積均小于對照組(P＜0.05)，PAB組與ADR組無顯著性差異(P＞0.05)，聯(lián)合給藥組較各組抑瘤作

7、用增強(P＜0.05)，抑瘤率為88.1％;對于SGC7901/ADR細胞移植瘤，ADR組、PAB組、聯(lián)合給藥組抑瘤效果依次增強(P＜0.05)，抑瘤率分別為:21.9％、64.1％、85.8％。
　　2、免疫組織化學法檢測Cox-2、PKC-α及P-gp的表達
　　SGC7901/ADR細胞移植瘤對照組瘤組織中Cox-2、PKC-α、P-gp蛋白呈高表達，PAB組蛋白陽性表達低于ADR組(P＜0.05)，聯(lián)合給藥組中三種蛋

8、白的陽性表達低于其余各組(P＜0.05)。在NS對照組中，SGC7901細胞移植瘤的蛋白表達低于SGC7901/ADR細胞移植瘤(P＜0.05)。
　　3、Westernblot法分析Cox-2、PKC-α、P-gp的表達
　　對于鹽水對照組，胃癌敏感細胞移植瘤中三種蛋白的表達水平均低于耐藥細胞移植瘤(P＜0.05);SGC7901/ADR細胞移植瘤中，鹽水對照組與吐溫對照組間蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)，Cox-2