羅格列酮對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞周期和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預(yù)后差，而且手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率較高，但是關(guān)于肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機(jī)制還不清楚，因此研究肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理以及探討新的治療措施具有極其重要的臨床意義。 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator activated receptor，PPARs)是一類配體依賴的序列特異的核轉(zhuǎn)

2、錄因子，因其具有被過(guò)氧化物酶體增殖物激活的特性，故而得名。迄今為止，已證實(shí)在脊椎動(dòng)物中存在PPAR α、PPAR β(或δ)、PPAR γ這3種亞型，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)、功能及組織分布上均有差異。PPARγ的生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，包括調(diào)控脂肪和糖代謝，脂肪細(xì)胞終末分化；控制單核細(xì)胞分化成熟，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成；抗肝纖維化作用；抗動(dòng)脈粥樣硬化，降血脂和降血壓；改善心功能衰竭和參與心室重構(gòu)等。最新

3、研究證實(shí)，PPARγ受體在多種腫瘤組織及細(xì)胞如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌及肝癌中過(guò)度表達(dá)，與癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡和腫瘤生成有關(guān)。 胰島敏劑噻唑烷二酮類化合物(thiazolidinedionesTzDs)，如羅格列酮(ciglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)等，是PPAR γ受體人工合成配體，這類藥增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性并具有降低血糖的作用，臨床上主要用

4、于Ⅱ型糖尿病的治療。最近研究認(rèn)為該類藥物可通過(guò)激活PPAR γ受體調(diào)控腫瘤細(xì)生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成等。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生命周期中的重要組成部分，是有機(jī)體調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)，是一種由內(nèi)在基因編碼調(diào)節(jié)，通過(guò)主動(dòng)的生化過(guò)程，使細(xì)胞自殺死亡的現(xiàn)象，也就是說(shuō)它是基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞自主性死亡過(guò)程。目前認(rèn)為與凋亡調(diào)控有關(guān)的基因有三類：抑制凋亡的基因、促進(jìn)凋亡的基因和凋亡過(guò)程中起協(xié)助作用的基因。p27<'kipl>作為近

5、年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的負(fù)性細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，屬于CDKI中Cip/Kip家族。p27<'kipL>主要作用是通過(guò)在G<,1>期對(duì)cvdinE和CDK2結(jié)合的抑制，阻止細(xì)胞周期由G<,1>期進(jìn)展到S期，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，使細(xì)胞發(fā)生肥大或凋亡。細(xì)胞S期激酶相關(guān)蛋白2(S-phase Kinase associated protein 2 Skp2)是一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，Skp2是泛素連接酶E3結(jié)合磷酸化的p27<'kip>識(shí)別蛋白質(zhì)，參與p27<

6、'kip>的泛素化降解。Skp2的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)換關(guān)卡的作用，有促進(jìn)細(xì)胞周期的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。近年揭示Skp2在多種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，但其對(duì)腫瘤的作用還未完全闡明。 本研究擬檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中PPAR γ mRNA的表達(dá)及不同濃度羅格列酮對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期及凋亡率的影響，并檢測(cè)與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的細(xì)胞因子p27<'kip>及Skp2的變化，從而探討羅格列酮誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及對(duì)細(xì)胞周期調(diào)

7、控的可能機(jī)制。 方法：對(duì)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reVersetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞PPAR γ mRNA表達(dá)的變化，以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠掃描；羅格列酮分別取0、0.1、1、10、100μmol/L5個(gè)濃度組，其中10 μmo/L濃度組取2

8、4h、48h、72h三個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞，采用FCM檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度羅格列酮對(duì)肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞周期和凋亡率的影響；以Westem-blot方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度羅格列酮對(duì)SMMC-7721 p27<'kip>及Skp2蛋白表達(dá)的變化，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。 結(jié)果： 1 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示SMMC-7721中存在PPAR γ mRNA表達(dá)。 2 FCM結(jié)果顯示，羅格列酮使SM

9、MC-7721細(xì)胞的G<,0>/G<,1>期比例顯著升高(P<0.05)，S期比例輕度降低(P<0.05)，G<,2>/M期明顯降低(P<0.05)，并且呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。同時(shí)羅格列酮對(duì)SMMC-7721細(xì)胞引起了顯著的細(xì)胞凋亡，由于藥物濃度和作用時(shí)間不同，細(xì)胞的凋亡率范圍從5.15％～17.36％；但低濃度羅格列酮(0.1 μmol/L)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用不明顯P>0.05)，但隨著藥物濃度的增加，羅格列酮的促凋亡作用明顯增

10、加并且呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性(P<0.05)。 3 Westen blot結(jié)果顯示羅格列酮能明顯降低Skp2蛋白的表達(dá)，且抑制作用呈明顯時(shí)間及劑量依賴性(P<0.05)。羅格列酮使SMMC-7721細(xì)胞p27<'kjp>蛋白表達(dá)量明顯升高，并且呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性(P<0.05)。 結(jié)論： 1 人肝癌細(xì)胞系SMMC.7721中存在PPARγ mRMA表達(dá)，位于360 bp處。 2 羅格列酮使S