羅格列酮對肝癌SMMC-7721細胞周期和凋亡的影響及其可能的作用機制.pdf

1、目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，預后差，而且手術治療后復發(fā)率較高，但是關于肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展的確切分子機制還不清楚，因此研究肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展機理以及探討新的治療措施具有極其重要的臨床意義。 過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator activated receptor，PPARs)是一類配體依賴的序列特異的核轉(zhuǎn)

2、錄因子，因其具有被過氧化物酶體增殖物激活的特性，故而得名。迄今為止，已證實在脊椎動物中存在PPAR α、PPAR β(或δ)、PPAR γ這3種亞型，它們在結構、功能及組織分布上均有差異。PPARγ的生物學功能復雜多樣，包括調(diào)控脂肪和糖代謝，脂肪細胞終末分化；控制單核細胞分化成熟，誘導巨噬細胞凋亡，抑制炎癥反應；誘導腫瘤細胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成；抗肝纖維化作用；抗動脈粥樣硬化，降血脂和降血壓；改善心功能衰竭和參與心室重構等。最新

3、研究證實，PPARγ受體在多種腫瘤組織及細胞如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌及肝癌中過度表達，與癌細胞增殖、分化、凋亡和腫瘤生成有關。 胰島敏劑噻唑烷二酮類化合物(thiazolidinedionesTzDs)，如羅格列酮(ciglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)等，是PPAR γ受體人工合成配體，這類藥增強機體對胰島素的敏感性并具有降低血糖的作用，臨床上主要用

4、于Ⅱ型糖尿病的治療。最近研究認為該類藥物可通過激活PPAR γ受體調(diào)控腫瘤細生長、促進腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成等。細胞凋亡是細胞生命周期中的重要組成部分，是有機體調(diào)控機體發(fā)育，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要環(huán)節(jié)，是一種由內(nèi)在基因編碼調(diào)節(jié)，通過主動的生化過程，使細胞自殺死亡的現(xiàn)象，也就是說它是基因嚴格控制的細胞自主性死亡過程。目前認為與凋亡調(diào)控有關的基因有三類：抑制凋亡的基因、促進凋亡的基因和凋亡過程中起協(xié)助作用的基因。p27<'kipl>作為近

5、年來新發(fā)現(xiàn)的負性細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，屬于CDKI中Cip/Kip家族。p27<'kipL>主要作用是通過在G<,1>期對cvdinE和CDK2結合的抑制，阻止細胞周期由G<,1>期進展到S期，從而導致細胞周期停滯，使細胞發(fā)生肥大或凋亡。細胞S期激酶相關蛋白2(S-phase Kinase associated protein 2 Skp2)是一種新發(fā)現(xiàn)的癌基因，Skp2是泛素連接酶E3結合磷酸化的p27<'kip>識別蛋白質(zhì)，參與p27<

6、'kip>的泛素化降解。Skp2的主要作用是促進細胞通過轉(zhuǎn)換關卡的作用，有促進細胞周期的作用，從而促進細胞增殖。近年揭示Skp2在多種腫瘤中過度表達，但其對腫瘤的作用還未完全闡明。 本研究擬檢測肝癌細胞系中PPAR γ mRNA的表達及不同濃度羅格列酮對SMMC-7721細胞周期及凋亡率的影響，并檢測與細胞周期調(diào)控相關的細胞因子p27<'kip>及Skp2的變化，從而探討羅格列酮誘導肝癌SMMC-7721細胞凋亡及對細胞周期調(diào)

7、控的可能機制。 方法：對人肝細胞癌細胞株SMMC-7721細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。采用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈式反應(reVersetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)技術，檢測SMMC-7721細胞PPAR γ mRNA表達的變化，以β-actin作為內(nèi)參照標準，并對擴增產(chǎn)物進行凝膠掃描；羅格列酮分別取0、0.1、1、10、100μmol/L5個濃度組，其中10 μmo/L濃度組取2

8、4h、48h、72h三個作用時間點培養(yǎng)細胞，采用FCM檢測不同時間點、不同濃度羅格列酮對肝癌細胞株SMMC-7721細胞周期和凋亡率的影響；以Westem-blot方法檢測不同時間點、不同濃度羅格列酮對SMMC-7721 p27<'kip>及Skp2蛋白表達的變化，并進行相對定量分析。 結果： 1 RT-PCR檢測結果顯示SMMC-7721中存在PPAR γ mRNA表達。 2 FCM結果顯示，羅格列酮使SM

9、MC-7721細胞的G<,0>/G<,1>期比例顯著升高(P<0.05)，S期比例輕度降低(P<0.05)，G<,2>/M期明顯降低(P<0.05)，并且呈時間依賴性和劑量依賴性。同時羅格列酮對SMMC-7721細胞引起了顯著的細胞凋亡，由于藥物濃度和作用時間不同，細胞的凋亡率范圍從5.15％～17.36％；但低濃度羅格列酮(0.1 μmol/L)促進肝癌細胞凋亡作用不明顯P>0.05)，但隨著藥物濃度的增加，羅格列酮的促凋亡作用明顯增

10、加并且呈時間依賴性和劑量依賴性(P<0.05)。 3 Westen blot結果顯示羅格列酮能明顯降低Skp2蛋白的表達，且抑制作用呈明顯時間及劑量依賴性(P<0.05)。羅格列酮使SMMC-7721細胞p27<'kjp>蛋白表達量明顯升高，并且呈時間依賴性和劑量依賴性(P<0.05)。 結論： 1 人肝癌細胞系SMMC.7721中存在PPARγ mRMA表達，位于360 bp處。 2 羅格列酮使S