慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能減退及其機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的
　　 慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructivepulmonarydisease，COPD）是一種以持續(xù)存在的呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的常見疾病，伴有氣道和肺對有害顆粒或氣體所致慢性炎癥反應(yīng)的增加。氣道、肺實(shí)質(zhì)及肺血管的慢性炎癥是COPD的特征性改變，多種炎癥細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）參與了COPD的發(fā)病過程。越來越多的研究資料表明，嚴(yán)重的COPD患者存在發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)的高風(fēng)險(xiǎn)

2、。
　　 曲霉是一種條件致病菌，對于免疫功能正常的人，曲霉孢子吸入人體后可以被天然免疫系統(tǒng)清除;但是免疫功能低下的病人，曲霉孢子吸入在肺部后，可以在肺部大量繁殖，在一定條件下導(dǎo)致肺部的侵襲性感染并可隨血循環(huán)播散到其他器官，甚至可能導(dǎo)致死亡。研究資料表明，COPD是ICU患者曲霉感染重要的危險(xiǎn)因素。有學(xué)者認(rèn)為大劑量使用糖皮質(zhì)激素、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)運(yùn)用廣譜抗生素、肺功能Ⅲ級以上、營養(yǎng)不良等因素可能增加COPD患者曲霉感染的風(fēng)險(xiǎn)，但

3、這種觀點(diǎn)缺乏大量相關(guān)的研究資料來佐證。而本實(shí)驗(yàn)室前期的臨床研究資料表明，COPD患者穩(wěn)定期全身使用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素使用時(shí)間大于10d是發(fā)生IPA的相關(guān)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。COPD患者曲霉易感性增加的具體機(jī)制尚不清楚，可能與機(jī)體防疫功能的減退——尤其是與巨噬細(xì)胞吞噬功能的減退有關(guān)。
　　 國內(nèi)外大量的研究表明，長期吸煙可能影響AM(alveolarmacrophages，AM)功能，導(dǎo)致肺的免疫功能受損

4、，從而使COPD患者呼吸系統(tǒng)細(xì)菌定植以及肺部感染發(fā)生率增高。肺泡巨噬細(xì)胞是機(jī)體的第一道防線，在清除煙曲霉分生孢子的過程中扮演著重要的角色。巨噬細(xì)胞要通過吞噬作用與殺滅作用才能將曲霉孢子清除，吞噬作用作為清除過程的首要步驟，就顯得尤為重要。巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用需依賴其表面的模式識別受體(Pathogenrecognitionreceptors，PRRs)對曲霉孢子的識別。在所有相關(guān)的PRRs中，與曲霉分生孢子關(guān)系較為密切的是Toll樣受體

5、(TollLikeReceptors，TLRs)。其中，TLR2是TLRs中與煙曲霉關(guān)系最為密切的一種。它能識別煙曲霉PAMP，如β-葡聚糖、角質(zhì)素、肽聚糖、甘露糖蛋白及其他細(xì)胞壁成分，通過MyD88髓樣分化蛋白或非MyD88轉(zhuǎn)接蛋白，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，從而引起多種細(xì)胞因子——如IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α等的表達(dá)分泌，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的殺菌和吞噬活性。Meier等研究證實(shí)，小鼠巨噬細(xì)胞識別曲霉孢子依賴TLR2。進(jìn)一步

6、的體外研究提示，巨噬細(xì)胞通過TLR2等識別曲霉孢子，引起促炎因子的產(chǎn)生與釋放，同時(shí)募集中性粒細(xì)胞至感染部位。
　　 本研究采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法建立COPD大鼠模型，并通過病理來評價(jià)模型。在成功建立COPD大鼠模型的基礎(chǔ)上，我們研究了COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞對曲霉孢子吞噬功能的變化、分泌炎癥因子的特點(diǎn)及可能的調(diào)控機(jī)制;從基因水平和蛋白水平研究了COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)情況。
　　 研究方法:
　　

7、 1慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及鑒定
　　 1.1COPD大鼠模型的建立:采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法，動物每天置于煙室內(nèi)三次，每次45分鐘，COPD組向煙室內(nèi)注入香煙煙霧，對照組注入空氣，共30天（第9、19天除外）。第9、19天試驗(yàn)組氣道內(nèi)注入濃度為1mg/mL內(nèi)毒素200μL，對照組滴入等量生理鹽水。
　　 1.2COPD大鼠模型的鑒定:第30天將大鼠處死，支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù);取下右肺，經(jīng)

8、多聚甲醛固定、病理切片、HE染色，用病理評分的方法對模型進(jìn)行鑒定。
　　 1.3數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(-x)±s表示，服從正態(tài)分布的方差齊性計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，方差分析不齊時(shí)采用Welch近似t檢驗(yàn)，以α=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌和吞噬功能的變化
　　 2.1COPD大鼠模型的建立同上。
　　 2

9、.2肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定:對大鼠進(jìn)行肺泡灌洗，將收集的BALF離心后獲得的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2孵育2h后去掉未貼壁細(xì)胞，并利用CD68單抗對貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測，呈綠色熒光即為肺泡巨噬細(xì)胞。
　　 2.3培養(yǎng)上清炎癥因子的測定:同上法分離大鼠肺泡巨噬細(xì)胞并培養(yǎng)2h，收集培養(yǎng)上清，采用ELISA測定肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、MIP-2、IL-10及IL-1β的表達(dá)。

10、　　 2.4肺泡巨噬細(xì)胞對曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)的測定:BALF離心后獲得的細(xì)胞以1×106/mL接種到六孔板，37℃，5％CO2孵育2h后去上清，加入曲霉孢子混懸液20μL，補(bǔ)足培養(yǎng)體積至1mL，37℃，5％CO2孵育2h，取出蓋玻片行PAS染色，計(jì)數(shù)吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=（吞噬孢子的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞總數(shù)）×100％;吞噬指數(shù)=吞噬孢子的總數(shù)/吞噬孢子的巨噬細(xì)胞數(shù)。
　　 2.5肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB的表達(dá)檢

11、測:提取肺泡巨噬細(xì)胞胞漿、胞核蛋白，運(yùn)用Westernblot技術(shù)測定NF-κB的表達(dá)。
　　 2.6數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(-x)±S表示，服從正態(tài)分布的方差齊性計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，方差分析不齊時(shí)采用Welch近似t檢驗(yàn)，以α=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)
　　 3.1COPD大鼠模型的建立同上。<

12、br>　　 3.2肺泡巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及處理:將收集的BALF離心后獲得的細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2孵育2h后去掉未貼壁細(xì)胞，然后于各組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中分別加入Pam3CYK4（每孔加1ug，濃度1mg/mL）和曲霉孢子（每孔加2.5×106個(gè)孢子）及1mL生理鹽水，各自培養(yǎng)4h后收集細(xì)胞。
　　 3.3肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá):提取細(xì)胞總蛋白，運(yùn)用qRT-PCR及Westernblot技術(shù)，檢

13、測大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)。
　　 3.4數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(-x)±S）表示，主效應(yīng)與交互效應(yīng)采用析因分析，單獨(dú)效應(yīng)采用單因素方差分析，以α=0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果
　　 1慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立
　　 1.1成功建立COPD模型:COPD組肺組織鏡下可見支氣管纖毛柱狀上皮呈鋸齒樣增生增厚，纖毛倒伏，上皮脫落，支氣管腔內(nèi)

14、中性粒細(xì)胞及黏液蓄積，管壁結(jié)締組織增生，平滑肌增厚，可見單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管周圍可見淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄、斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成較大的囊腔。COPD組支氣管炎癥評分顯著高于對照組(4.33±1.16vs.1.33±0.58，P=0.016)。COPD組平均內(nèi)襯間隔(MLI)顯著高于對照組[（168.77±11.35）μmvs.（93.61±4.16）μm，P=0.000）]。BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù):COPD組

15、BALF中白細(xì)胞總數(shù)較對照組顯著升高[（2.34±0.15）×108/Lvs.（1.72±0.30）×108/L，P=0.002]，分類以肺泡巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞為主[（72.0±2.2）％和（18.3±8.3）％]。
　　 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌和吞噬功能的變化
　　 2.1細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-1β的濃度:COPD組肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2的濃度顯

16、著高于對照組（均為P=0.000），IL-10、IL-1β濃度在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均為P＞0.05）。
　　 2.2肺泡巨噬細(xì)胞對曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù):對照組肺泡巨噬細(xì)胞對曲霉孢子的吞噬率顯著高于COPD組（P=0.000）;而對照組與COPD組肺泡巨噬細(xì)胞對曲霉孢子的吞噬指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.053）。
　　 2.3NF-κBp65的表達(dá):COPD組肺泡巨噬細(xì)胞胞漿NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平顯著低于

17、對照組（P=0.011），而胞核的表達(dá)水平則顯著高于對照組(P=0.003)。
　　 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)
　　 3.1大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因表達(dá)水平
　　 3.1.1經(jīng)析因分析顯示，對照組與COPD組相比，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=680.60，P=0.000)。三個(gè)處理因素相比，曲霉孢子對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度

18、影響最大，Pam3CYK4次之，生理鹽水對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度影響最小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=353.21，P=0.000）。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(yīng)（F=17.79，P=0.000），即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后，肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的差異比對照組大;可認(rèn)為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因的表達(dá)水

19、平。
　　 3.1.2基礎(chǔ)狀態(tài)下，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3.1.3滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度均高于基礎(chǔ)狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);滴加曲霉孢子或Pam3

20、CYK4的對照組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度也均高于基礎(chǔ)狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3.2大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平
　　 3.2.1經(jīng)析因分析顯示，對照組與COPD組相比，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=349.58，P=0.000）。三個(gè)處理因素相比，曲霉孢子對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平影響最大，Pam3CYK4次之，生理鹽

21、水對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平影響最小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=77.08，P=0.000）。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(yīng)（F=18.07，P=0.000），即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后，肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白表達(dá)水平的差異比對照組大;可認(rèn)為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平。
　　 3.2.2基礎(chǔ)狀態(tài)下

22、，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后，COPD組肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平均低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。
　　 3.2.3滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2蛋白的表達(dá)水平均高于基礎(chǔ)狀態(tài)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的對照組肺泡巨噬細(xì)胞TLR