大腸癌新型CEA疫苗的優(yōu)化設(shè)計及其重組桿狀病毒的表達(dá)及鑒定.pdf

1、背景和目的：大腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一。目前對于晚期大腸癌或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的病例，尚無有效的治療手段。研發(fā)大腸癌高效的腫瘤疫苗，是目前的研究熱點之一，現(xiàn)也已被視為未來提高其臨床治愈率的希望所在。本課題結(jié)合表位生物學(xué)進(jìn)展和臨床病理學(xué)基礎(chǔ)，提出針對大腸癌的新型CEA疫苗設(shè)計方案：以CEAHLA-A2限制性CTL表位與PADRE(非天然通用Th表位)作為CEA疫苗的融合治療表位，以人類乳頭狀病毒16型晚期結(jié)構(gòu)蛋白(HPV16L1)作為CEA

2、疫苗的蛋白載體，并以安全、高效的真核細(xì)胞表達(dá)體系——BactoBac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白。在疫苗的設(shè)計上，兼顧了安全性和高效性，綜合利用各組分的免疫特性，使之可能發(fā)揮協(xié)同作用，有利于打破機體對CEA的免疫耐受，激發(fā)高效、持久的CTL反應(yīng)，從而為大腸癌的治療探索新的方法。 方法：1、根據(jù)HPV16L1基因圖譜和其蛋白形成病毒性顆粒的結(jié)構(gòu)特性，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ位點的引物，選擇性從質(zhì)粒114KLlpFa

3、stBac1擴增HPV16ΔL1片段(去除編碼其C末端34個氨基酸殘基的序列)，并將其連入T載體。2、采取定向克隆的方法，將HPV16ΔL片段克隆到空載體pFastBacl的SalⅠ和NotⅠ位點，構(gòu)建中間質(zhì)粒HPV16ΔL1pFastBac1，并測序驗證。3、設(shè)計、合成含有限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XbaⅠ位點的編碼CEAHLA-A2限制性CTL表位和通用性Th表位PADRE的可退火引物，將其克隆至中間質(zhì)粒HPV16ΔL1pFastBac

4、l的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建新型CEA疫苗的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，測序并酶切鑒定。4、用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH10Bac，通過轉(zhuǎn)座效應(yīng)得到融合表位疫苗的重組桿狀病毒表達(dá)載體。5、用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，并通過PCR鑒定重組桿狀病毒。6、采用免疫組化染色檢測45例大腸癌中HPV16殼蛋白抗原(HPV16L1)、P53、PCNA的表達(dá)。 結(jié)果：1、對克隆的HPV16ΔL1片段的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在1.6kb附近見

5、到一特異性條帶，表明HPV16ΔL1片段克隆成功。2、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和XbaⅠ雙酶切后，得到目的片段和載體片段，測序結(jié)果符合設(shè)計序列，表明連接成功。3、提取感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞DNA后，PCR證實其產(chǎn)物為所需序列。4、大腸癌中HPV16L1陽性表達(dá)46.7％(21/45)，在性別、臨床分期、組織類型和分化程度之間差異均不顯著；大腸癌中p53陽性表達(dá)53.3％(24/45)，其中13例HPV16感染，兩者無明顯相關(guān)

6、性(P=0.286＞0.05)。大腸癌中PCNA高表達(dá)75.6％(34/45)，其中19例HPV16感染，PCNA高表達(dá)和HPV16感染呈正相關(guān)(P=0.031＜0.05)；在大腸癌中，P53蛋白表達(dá)與PCNA高表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.008＜0.05)。 結(jié)論：1、我們成功克隆了HPV16片段。2、通過定向克隆成功地構(gòu)建了新型CEA疫苗重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。3、轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，成功獲得新型CEA疫苗的重組桿狀病毒。4、HPV1