一種新的萘酚類衍生物1-羥基-2-萘甲酸甲酯的抗炎作用及其作用機制的研究.pdf

1、炎癥是機體組織對損傷性刺激的一種防御性反應，它是一個由多細胞（比如淋巴細胞、巨噬細胞、粒細胞、內(nèi)皮細胞等）、多成分（細胞因子，血管活性物質(zhì)、趨化因子、粘附因子、炎癥相關酶類）參與的復雜的過程。在炎癥過程中，一方面損傷因子直接或間接造成組織和細胞的破壞，另一方面通過炎癥充血和滲出反應，以稀釋、殺傷和包圍損傷因子。同時通過實質(zhì)和間質(zhì)細胞的再生使受損的組織得以修復和愈合。因此炎癥是損傷和抗損傷的統(tǒng)一過程。適當?shù)难装Y反應對人體抵抗損傷、清除感染

2、，促進傷口的愈合是有益的，然而過度的炎癥反應會導致持久性的組織損傷，進而影響我們的身體健康。
　　 巨噬細胞是由血液中單核細胞遷入組織后分化而成的，它在不同器官、組織中均有分布，例如:肺中的肺泡巨噬細胞、肝臟中的枯否氏細胞、神經(jīng)組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及骨組織中的蝕骨細胞等等。巨噬細胞是機體內(nèi)重要的一種免疫細胞，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用。同時它又是體內(nèi)啟動炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細胞。巨噬細胞能夠被多種炎癥性刺激所激活，其中就

3、包括作用較強的細菌脂多糖。細菌脂多糖又稱內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細菌致病的主要因素，具有較強激活單核巨噬細胞的作用。當革蘭氏陰性細菌在死亡或進行繁殖時釋放出來的LPS進人宿主體內(nèi)，可誘導單核巨噬細胞合成并釋放多種炎癥介質(zhì)，諸如:NO、前列腺素PGs以及促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等，導致機體出現(xiàn)一系列的炎癥反應，嚴重的可以出現(xiàn)中毒性休克，全身炎癥反應綜合征以及多器官功能衰竭等。巨噬細胞及其釋放的炎癥介質(zhì)在炎癥過程中扮演了一

4、個重要的角色。目前研究認為巨噬細胞參與了多種炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，例如，動脈粥樣硬化、風濕性關節(jié)炎、炎癥性腸病、敗血癥等。
　　 NO是一種毒性較強的氣體自由基，其在體內(nèi)由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)催化左旋精氨酸而產(chǎn)生，具有廣泛的生物學功能。NO是重要的細胞信號分子，同時還參與神經(jīng)信息傳遞、心肺功能調(diào)節(jié)、細胞凋亡以及免疫防御等多個過程。目前已知的NOS有神經(jīng)型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS

5、(eNOS)及誘生型NOS(iNOS)，前兩者又稱為結構型NOS(cNOS)，由cNOS催化生成的NO濃度很低，主要參與生理過程，維持細胞的正常功能。而巨噬細胞產(chǎn)生的NO濃度高，主要由誘導性一氧化氮合酶催化產(chǎn)生。短期、大量的NO釋放使巨噬細胞具有殺傷微生物以及腫瘤細胞的作用，然而長期、過度的NO會通過DNA損傷、線粒體呼吸抑制、活性氮等細胞毒性效應介導細胞和組織的損傷，進而參與某些炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展。因此，抑制NO的過量表達已經(jīng)成為

6、預防炎癥反應和疾病的研究熱點。
　　 前列腺素(prostaglandins，PGS)是廣泛存在于動物和人體內(nèi)的一組重要的組織激素，不僅對心血管、胃腸道、呼吸和生殖系統(tǒng)的功能有強烈的調(diào)節(jié)作用，而且還是炎癥、發(fā)熱及疼痛發(fā)生和發(fā)展的一個關鍵介質(zhì)。環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素的關鍵酶，包括COX-1、COX-2和COX-3三種亞型。COX-1和COX-3為結構型環(huán)氧化酶，主要存在于血管、

7、胃、腎等組織中，參與血管舒縮、血小板聚集、胃粘膜血流、胃黏液分泌及腎功能等的調(diào)節(jié)，其功能與保護胃腸黏膜、調(diào)節(jié)血小板聚集、調(diào)節(jié)外周血管的阻力和調(diào)節(jié)腎血流量分布有關。COX-2為誘導型環(huán)氧化酶，在正常組織中幾乎不表達，但在活化的巨噬細胞中卻誘導性地大量表達。傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥例如阿司匹林、羅非昔布等通過抑制環(huán)氧化酶的活性，減少了前列腺素的產(chǎn)生，進而具有解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用。這一類藥物已經(jīng)被廣泛的應用于治療風濕性關節(jié)炎以及其他炎癥性疾病當中。<

8、br>　　 TNF-α、IL-1β以及IL-6均是促炎性細胞因子，它們可以直接激活免疫效應細胞（如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞等），也可以旁分泌或自分泌的形式促進其他炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，進而擴大炎癥反應。正常水平的TNF-α、IL-1β以及IL-6對調(diào)節(jié)免疫應答、抗感染、促進組織修復、引起腫瘤細胞凋亡等至關重要，然而促炎性細胞因子的大量產(chǎn)生和釋放則會破壞機體的免疫平衡，引起過度的炎癥反應，介導炎癥性疾病的發(fā)生。例如，某些炎癥性疾病如

9、類風濕關節(jié)炎患者血液循環(huán)當中的促炎性細胞因子就有不同程度的增加，其水平與疾病的嚴重程度往往具有一定的相關性。而且通過使用單克隆抗體或受體拮抗劑阻斷促炎性細胞因子介導的效應，在治療某些炎癥性疾病上已取得了良好的治療效果。
　　 巨噬細胞產(chǎn)生上述炎癥介質(zhì)是通過復雜的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的激活而實現(xiàn)的，其中與巨噬細胞炎癥基因和蛋白表達關系最密切的是轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和有絲分裂原蛋白激酶MAPKs.
　　 NF-κB(nuclea

10、rfactor-κB)是一類廣泛存在于哺乳動物細胞中、具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子，它能夠參與機體的炎癥反應、免疫反應、細胞分化與凋亡及其它應激反應。在哺乳動物細胞中，NF-κB通常以p50/p65異源二聚體形式存在。當細胞在靜息狀態(tài)下，NF-kB與其抑制性蛋白IκB結合，并以三聚體的無活性形式存在于胞漿中。當細胞受到外來刺激時，IκB發(fā)生磷酸化并被降解，NF-κB被解除抑制從胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核中，并與靶基因上游調(diào)控序列結合，啟動相關

11、基因的轉(zhuǎn)錄。NF-kB的激活主要是通過IκB的降解來調(diào)節(jié)的，然而越來越多的研究表明:NF-kB的活性調(diào)節(jié)還可以通過NF-kB蛋白的磷酸化和乙酞化等直接修飾作用來實現(xiàn)。例如酪蛋白激酶Ⅱ能夠通過磷酸化p65亞基的529位絲氨酸殘基，增強NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 NF-κB信號傳導通路是LPS所介導的信號傳導通路中最重要的下游通路。也是巨噬細胞激活的中心環(huán)節(jié)。當巨噬細胞NF-κB被激活后，可迅速誘導炎癥細胞因子、粘附分子、趨化分子

12、以及炎癥相關酶類的表達。如TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2等。因此阻斷NF-κB信號通路的活化，可以減少多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎的作用。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases，MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸和（或）蘇氨酸蛋白激酶，是細胞應激和損傷反應的主要信號通路，在炎癥信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡、腫瘤細胞增殖及參與調(diào)控體內(nèi)多種物質(zhì)代謝過程中起著重要作用。

13、MAPKs家族有三條經(jīng)典的亞族通路，分別是細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellularSignal-regulatedkinases1/2，ERKI/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase，JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-ActivatedProteinKinases，p38-MApK)。MAPKs的激活（主要是通過磷酸化）是LPS作用于單核/巨噬細胞后發(fā)生的細胞內(nèi)早期

14、事件之一，而且MAPKs的底物多為核轉(zhuǎn)錄因子，其中就包括NF-κB、AP-1等，因此MAPKs與炎性細胞因子的合成和分泌密切相關。
　　 巨噬細胞激活及其釋放的炎癥介質(zhì)在炎癥性疾病當中發(fā)揮了重要的作用，因此抑制活化巨噬細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)已經(jīng)成為抗炎藥物治療和研究的靶點。而且更讓人關注的是:以抑制巨噬細胞激活和抑制巨噬細胞過度釋放炎癥介質(zhì)為靶點的這類抗炎藥物，與傳統(tǒng)的抗炎藥物相比在理論有自己獨特的優(yōu)勢。
　　 在我國，抗炎藥

15、物是僅次于抗感染藥物的第二大類藥物。目前的抗炎免疫藥物主要分為三大類，即甾體類抗炎藥和非甾體類抗炎藥(NSAIDs)以及疾病調(diào)修藥，三類抗炎免疫藥物在臨床上已經(jīng)被廣泛地應用。甾體類抗炎藥主要有糖皮質(zhì)激素類藥物如地塞米松等，具有廣泛的生理和藥理作用，但長期應用有引起物質(zhì)代謝和水鹽代謝紊亂，誘發(fā)或加重感染，導致骨質(zhì)疏松等毒副作用;非甾體類抗炎藥物主要是通過抑制COX進而抑制前列腺素(PGs)的產(chǎn)生，而發(fā)揮抗炎作用。可細分為非選擇性COX抑制

16、劑（如阿司匹林）以及選擇性COX-2抑制劑（如塞來昔布）等，非選擇性COX抑制劑因為選擇性低，所以會引起很多的毒副反應，選擇性COX-2抑制劑毒副作用少，然而隨著研究發(fā)現(xiàn)COX-2在大腦、精囊及腎臟中也存在結構型表達，如果抑制這些組織中的COX-2活性會產(chǎn)生哪些負面的影響，需要引起大家進一步的重視。疾病調(diào)修藥包括免疫抑制劑、免疫增強劑以及免疫調(diào)節(jié)劑，這類藥物對免疫功能有抑制或增強或雙向調(diào)節(jié)的作用。例如、雷帕霉素以及來氟米特等具有抑制免疫

17、反應的作用，主要用于器官移植的抗排斥反應;左旋咪唑作為免疫促進劑主要用于自身免疫性疾病的治療，還可作為腫瘤治療的輔助用藥等。
　　 隨著抗炎免疫藥理學研究的不斷深入以及人們在炎癥反應細胞分子機制方面取得的研究進展，迫切需要我們尋找更多抗炎效果好、毒副作用少，能夠長期應用的抗炎藥物。然而抑制巨噬細胞激活及其介導的炎癥反應就是一個非常好的以細胞為整體的藥物研究靶點。
　　 萘酚類衍生物是一類在萘環(huán)上含有羥基的化合物，它們作為

18、原料藥在醫(yī)藥與工業(yè)行業(yè)當中被廣泛地應用。整理文獻發(fā)現(xiàn):萘酚類衍生物的研究文獻主要集中在化學層面、而有關其活性方面的文章并不多。現(xiàn)有已經(jīng)報道的萘酚類衍生物活性主要體現(xiàn)在以下幾個方面:抗細菌和真菌的活性;干擾糖的無氧酵解;促進膽汁分泌、抗腫瘤活性以及抗炎活性。鑒于萘酚類衍生物結構與功能的多樣性，這類化合物的抗炎活性尤為讓人關注。研究發(fā)現(xiàn)2-取代-1-萘酚類衍生物具有抑制環(huán)氧化酶和脂氧合酶的作用。1,4-二羥基萘甲酸具有抑制骨吸收以及DSS誘

19、導結腸炎的作用。
　　 基于上述研究背景，我們準備以脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥模型以及酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎模型，對萘酚類衍生物1-羥基2-萘甲酸甲酯(Methyl-1-hydroxy-2-naphthoate，MHNA)的體內(nèi)外的抗炎活性及其可能的作用機制進行了深入的探討。
　　 主要研究方法和結果分為三個部分:
　　 一、MHNA抑制脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應
　　 1、MHNA對巨噬細胞細胞活力沒

20、有明顯影響。
　　 采用MTT法首先分析0-40μg/ml濃度范圍內(nèi)的MHNA對RAW264.7細胞活力的影響。MHNA在劑量達到40μg/ml濃度與巨噬細胞RAW264.7作用24h時，對巨噬細胞活力沒有明顯影響（差異無統(tǒng)計學意義）。因此本研究選取的MHNA最大劑量10μg/ml對巨噬細胞是安全的。
　　 2、MHNA抑制LPS激活的巨噬細胞產(chǎn)生NO、IL-1β以及IL-6。
　　 以2.5、5.0、10.0μ

21、g/mlMHNA以及0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細胞24h。留取細胞上清。用Griess試劑法檢測細胞培養(yǎng)基中的NO，ELISA方法檢測細胞上清中炎癥細胞因子TNF-a，IL-1β以及IL-6飛水平?；A水平的NO濃度在2.69±0.39μM.，100μg/ml的LPS作用24h巨噬細胞產(chǎn)生NO的濃度達到了21.78±1.24μM。MHNA在2.5-10μg/ml濃度范圍內(nèi)明顯抑制LPS誘導的巨噬細胞產(chǎn)生NO。而且MHN

22、A劑量依賴性地抑制LPS誘導地IL-1β以及IL-6的產(chǎn)生。然而它對巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-a的影響相對較小，只在高濃度10μg/ml才有輕微地抑制作用，且統(tǒng)計學無顯著性差異。
　　 3、MHNA抑制LPS誘導的巨噬細胞iNOS及COX-2蛋白的表達
　　 以2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA以及0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細胞24h。提取細胞總蛋白，用westernblot方法探討MHNA對巨噬細

23、胞激活后誘導性酶iNOS及COX-2表達的影響。結果表明，MHNA顯著抑制LPS誘導的巨噬細胞iNOS及COX-2蛋白的表達。
　　 4、MHNA抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥基因的表達
　　 以2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA以及終濃度為0.1μg/ml的LPS刺激RAW264.7細胞6h，提取細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，采用realtime-PCR方法，檢測細胞炎癥基因iNOS，COX-2，IL-1β以及IL-

24、6mRNA的表達。結果表明，MHNA對1ps誘導的巨噬細胞炎癥基因iNOS，COX-2，IL-1β以及IL-6mRNA的表達有明顯地抑制作用。
　　 二、MHNA體內(nèi)抗炎活性的研究
　　 1、MHNA抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹
　　 為了探討MHNA對急性炎癥滲出的影響，我們構建了二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹模型。結果表明，MHNA20、40、80mg/kg的劑量灌胃給藥，對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用

25、(P＜0.05)，且呈明顯的量效關系，抑制率分別為17.8％、29.5％，45.0％。
　　 2、MHNA減輕腹膜炎小鼠腹腔中蛋白與白細胞的滲出。
　　 為了進一步探討MHNA的體內(nèi)抗炎活性，我們構建了酵母多糖誘導的小鼠腹膜炎模型。研究表明:酵母多糖可以迅速誘導小鼠炎癥反應，引起小鼠腹腔灌洗液中出現(xiàn)大量的蛋白與白細胞。地塞米松10mg/kg以及MHNA40mg/kg，MHNA80mg/kg能顯著性抑制腹腔中蛋白的滲出（抑

26、制率分別是:45.9％，19.3％以及29.4％），而且還能抑制白細胞的浸潤（抑制率分別是:57.4％，22.5％以及38.6％）。
　　 3、MHNA抑制腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細胞因子IL-6的水平
　　 為了探討MHNA對酵母多糖誘導的腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細胞因子產(chǎn)生的影響，我們檢測了小鼠腹腔灌洗液中細胞因子IL-6的水平。研究結果表明:正常的小鼠腹腔中幾乎檢測不出IL-6，但是腹腔注射酵母多糖后6h，腹腔IL-6水平

27、明顯增高。地塞米松10mg/kg以及MHNA40mg/kg，MHNA80mg/kg顯著性抑制腹腔中IL-6的產(chǎn)生（抑制率分別是:48.7％，19.5％以及41.2％）。
　　 三、MHNA抗炎作用機制的探討
　　 1、MHNA抑制巨噬細胞NF-κB的激活
　　 為了探討MHNA抑制巨噬細胞炎癥反應的作用機制，我們分別用westernblot方法，報告基因方法，以及凝膠遷移實驗探討了MHNA對巨噬細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子N

28、F-κB激活的影響。RAW264.7細胞先與2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA作用1h，然后再與0.1μg/ml的LPS作用30min（免疫印跡法檢測iκB降解以及MAPKs的磷酸化）或1h（提取胞漿胞核蛋白，免疫印跡法檢測胞漿胞核中NF-κB的分布，凝膠遷移實驗檢測NF-κB與DNA的結合能力）Westernblot結果顯示:與未刺激的對照細胞相比，脂多糖刺激巨噬細胞后，細胞內(nèi)iκB降解明顯，胞漿內(nèi)NF-κB減少，胞核內(nèi)NF-

29、κB增多，表明脂多糖刺激可以誘導NF-κB由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。MHNA與脂多糖一起作用，明顯減弱了脂多糖引起的iκB降解、胞漿內(nèi)NF-κB減少以及胞核內(nèi)NF-κB增多的這一作用。
　　 報告基因結果顯示:0.1μg/ml脂多糖引起巨噬細胞NF-κB轉(zhuǎn)錄活性（反映為報告基因最后檢測的相對熒光信號的強弱）相比對照細胞提高了5.3倍，而MHNA對巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄活性有明顯地抑制。
　　 凝膠遷移實驗EMSA結果顯示:脂多糖引起巨

30、噬細胞NF-κB與其特異性結合的DNA序列結合能力增加，MHNA或NF-κB的特異性抑制劑BAY11-7082預處理巨噬細胞1h，均可以抑制脂多糖引起的NF-κB與DNA結合能力的增強。
　　 2、MHNA抑制巨噬細胞MAPKs的激活
　　 RAW264.7細胞先與2.5、5.0、10.0μg/mlMHNA作用1h，然后再與0.1μg/ml的LPS作用30min，提取細胞總蛋白，免疫印跡法檢測MAPKs(p38MAPK，

31、ERK1/2，以及JNK)的磷酸化。結果表明:脂多糖可以引起巨噬細胞p38MAPK，ERK1/2，以及JNK的磷酸化增加，而對總的p38MAPK,ERK1/2，以及JNK的蛋白水平?jīng)]有明顯影響。2.5-10.0μg/ml的MHNA劑量依賴性地抑制p38MAPK以及JNK的磷酸化，而對ERK1/2的磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。
　　 結論:
　　 一、本文首次發(fā)現(xiàn)，MHNA具有抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥反應的作用。具體表現(xiàn)為

32、:
　　 1、MHNA抑制激活的巨噬細胞炎癥介質(zhì)NO、IL-1β以及IL-6的產(chǎn)生;
　　 2、MHNA抑制激活的巨噬細胞iNOS與COX-2蛋白的表達;
　　 3、MHNA抑制激活的巨噬細胞炎癥基因(iNOS、COX-2、IL-1β、IL-6)的表達。
　　 二、MHNA具有良好的體內(nèi)抗炎活性。具體表現(xiàn)為:
　　 1、MHNA抑制了二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹
　　 2、MHNA減輕了酵母多

33、糖誘導的腹膜炎小鼠腹腔中蛋白與白細胞的滲出。
　　 3、MHNA抑制了酵母多糖誘導的腹膜炎小鼠腹腔中炎癥細胞因子IL-6的水平。
　　 三、MHNA通過抑制巨噬細胞NF-κB、p38MAPK以及JNK信號通路的激活進而抑制巨噬細胞激活及其介導的炎癥反應。
　　 綜上所述:MHNA通過阻斷NF-κB、p38MAPK以及JNK信號通路的活化，抑制了巨噬細胞的激活，減少了巨噬細胞炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而對巨噬細胞介導的炎癥