丹皮酚抗炎衍生物的設計合成及其機制研究.pdf

1、背景：炎癥是目前世界公認的三大疾病之一，最常見的是類風濕性關節(jié)炎(RA)和骨關節(jié)炎(OA)。RA是一種慢性的自身免疫性炎癥疾病，多關節(jié)受累為其主要表現，其容易導致患者殘疾，在全世界范圍內都具有很高的發(fā)病率。目前用于治療關節(jié)炎的藥物主要有甾體抗炎藥和非甾體抗炎藥，這兩類藥物雖然對關節(jié)炎類疾病治療效果顯著，但長期服用能造成消化道、肝臟、腎臟和心血管等不同程度的損傷。因此，尋找安全有效，毒副作用低的抗炎藥仍是藥物開發(fā)研究的熱點。牡丹皮作為我國

2、傳統(tǒng)藥用植物，其主要成分是丹皮酚，丹皮酚具有廣泛的藥理活性，如具有抗炎、抗菌、解熱鎮(zhèn)痛等作用。目前，以丹皮酚為主要成分開發(fā)的丹皮酚片、丹皮酚軟膏等抗炎藥物已經在市場上銷售，但是根據查閱文獻分析，有少量的文獻報道了丹皮酚具有抗關節(jié)炎的顯著效果，尤其是對佐劑性關節(jié)炎大鼠的足腫脹有較強抑制作用，但是有關丹皮酚及其衍生物在抗關節(jié)炎活性方面的報道較少，對其構效關系及抗炎機理方面的研究更少。所以本課題的研究內容，主要是基于丹皮酚的抗炎活性，以丹皮酚

3、為先導物，設計合成結構新穎的丹皮酚衍生物，進而初步探索衍生物的抗炎活性及其抗炎機制。
　　目的：基于環(huán)氧合酶-2(COX-2，4ux6)的蛋白受體結構，以具有抗炎作用的丹皮酚為先導物，設計不同丹皮酚衍生物作為配體，然后將理論上結合作用強的衍生物進行化學合成，通過體外和體內理化、生物指標評價其抗炎活性，在揭示衍生物抗炎作用機理的同時，建立丹皮酚與抗炎的構效關系，為今后丹皮酚類抗炎藥物的開發(fā)提供理論依據和技術支持。
　　方法：以

4、重慶市墊江牡丹皮為原料，通過醇提、萃取和結晶等方法獲得丹皮酚純品；然后通過計算機輔助藥物設計----基于COX-2酶受體結構，對丹皮酚衍生物進行設計并對接打分，根據得分結果，合成出相應的化合物，并利用紫外(UV)、紅外(IR)、高分辨質譜(HRMS)和核磁共振(NMR)對其結構進行確證和表征；繼而對合成的衍生物進行抗炎活性評價：在體外，用物理化學方法檢測丹皮酚衍生物清除自由基能力(DPPH，OH·，O2-·，ABTS+·)，熒光光度法分

5、析丹皮酚衍生物與人血清白蛋白的熒光淬滅作用；在體內，建立完全氟氏佐劑誘導的關節(jié)炎小鼠模型，用小鼠足趾容積測量儀測量衍生物對小鼠足腫脹抑制率；酶聯(lián)免疫吸附法測定炎癥小鼠血清中各種自由基和炎癥因子含量，最后對實驗結果進行分析，揭示丹皮酚衍生物抗炎機制的同時，建立構效關系。
　　結果：⑴基于環(huán)氧合酶-2(4ux6)受體結構，通過分子對接技術，設計合成了丹皮酚衍生物17個，其中的16個化合物被確證是新的化合物（化合物7a-h和8a-h），

6、在對接結果中，兩個系列化合物的打分優(yōu)于丹皮酚，其中化合物7h和8h在各自系列中分值最高。⑵在對衍生物的體外活性測試中，通過物理化學方法，測試了衍生物清除體外自由基的能力，兩個系列的化合物(7a-h和8a-h)都表現出較好的清除自由基的作用。而且其清除能力呈現規(guī)律性變化，隨著碳鏈的增長，其清除能力逐漸增強，其中化合物8h的清除能力最強，優(yōu)于維生素C對照藥；通過熒光法得出化合物對人血清白蛋白(HSA)有淬滅作用，其中化合物7、7a、8與HS

7、A相互作用為動態(tài)淬滅，化合物8h與HSA的相互作用過程不是動態(tài)淬滅，可能由于藥物8h與蛋白分子之間形成了新的非熒光性復合物所致。根據熱力學參數，確定溫度對藥物與蛋白間的結合能力影響很大，31℃時，藥物7、7h、8h與蛋白的主要結合力是氫鍵或者是范德華力，這與分子對接中藥物與受體蛋白結合形式的結果相一致。⑶在完全氟氏佐劑誘導的小鼠足腫脹炎癥模型中，化合物7、7a、8和8h都呈現出劑量依賴性的消腫作用，其足腫脹抑制率為：7h-H＞8h-H＞

8、Cel≥7-H>8h-L＞7h-L＞7-L＞8-H＞8-L＞Mod(H:高劑量，L:低劑量，Cel:塞來昔布)；在對炎癥小鼠的血清中，化合物7、7a、8和8a能提高T-AOC和SOD含量，其中高劑量的7h和8h效果最好；另外，化合物7、7h、8和8h也能抑制COX-2、PGE2和MDA的濃度，高劑量7和8抑制COX-2、PGE2效果好，7h和8h次之；高劑量的8h抑制MDA最強。
　　結論：基于COX-2酶的受體結構，設計合成出兩

9、個系列的丹皮酚衍生物7a-7h和8a-8h，化合物8h和7h比丹皮酚抗炎活性優(yōu)良，該結論與分子對接預期的活性規(guī)律基本一致。對于丹皮酚的結構修飾，在苯環(huán)上溴代和羥基醚化可提高抗炎活性，羥基醚化后的碳鏈長度對抗炎活性具有影響。化合物抗炎活性主要通過兩個方面體現出來：一是清除自由基，增加抗氧化能力，達到對自由基介質的抑制作用；二是通過抑制脂質介質COX-2和PGE2的活性，提高炎癥小鼠足腫脹抑制率。通過本課題的研究，得出了丹皮酚的分子結構和抗