應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)篩選激酶抑制劑.pdf

1、蛋白激酶是一類(lèi)磷酸轉(zhuǎn)移酶，可將ATP的γ磷酸基轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化。蛋白激酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生命活動(dòng)和疾病的進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。異常的磷酸化與許多疾病相關(guān)，如癌癥、炎癥或免疫系統(tǒng)紊亂等。以蛋白激酶作為藥物靶點(diǎn)，尋找與之相互作用的小分子化合物，并進(jìn)一步優(yōu)化用于新藥研發(fā)是當(dāng)今蛋白激酶研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。傳統(tǒng)的激酶抑制劑篩選方法雖然可以采用高通量的方式進(jìn)行，但仍然存在以下缺點(diǎn)：偶聯(lián)反應(yīng)易導(dǎo)致非特異性結(jié)果、放射性同

2、位素或熒光標(biāo)記底物價(jià)格昂貴并可能產(chǎn)生同位素污染、篩選操作過(guò)程復(fù)雜易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果等。因此，結(jié)合高通量的特點(diǎn)，尋求補(bǔ)充的激酶抑制劑的篩選方法非常有意義。 隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，質(zhì)譜的應(yīng)用范圍已擴(kuò)展到生命科學(xué)研究的許多領(lǐng)域。質(zhì)譜用于酶活性的測(cè)定及酶動(dòng)力學(xué)研究也越來(lái)越廣泛。本文應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)建立了激酶抑制劑的篩選方法，具體如下： (一)以新功能蛋白激酶RX218為研究對(duì)象，建立了激酶抑制劑高通量篩選方法。采用經(jīng)典

3、的Fmoc固相合成策略，以及平行合成及“混—分”編碼合成等組合化學(xué)技術(shù)合成了含有86條多肽的肽庫(kù)，并結(jié)合Kinase—Glo()發(fā)光檢測(cè)法篩選到了RX218激酶底物(Pep8)。以Pep8為底物，經(jīng)過(guò)優(yōu)化激酶反應(yīng)體系中的ATP濃度、激酶用量、底物Pep8濃度等首次建立了激酶RX218的Kinase—Glo()發(fā)光檢測(cè)篩選模型。應(yīng)用該模型對(duì)本課題組的640個(gè)單一純化合物進(jìn)行篩選后，發(fā)現(xiàn)8個(gè)活性化合物。其中活性較高的2個(gè)化合物的IC50值分

4、別為38.7μM(P3—A7)和43.2μM(V8807)。 (二)以Pep8為激酶RX218的多肽底物，采用HPLC—MS聯(lián)用技術(shù)中的質(zhì)譜閥切換功能進(jìn)行樣品脫鹽前處理，通過(guò)優(yōu)化液相梯度、質(zhì)譜檢測(cè)條件以及激酶反應(yīng)體系等，建立了激酶抑制劑的色譜—質(zhì)譜聯(lián)機(jī)篩選方法。研究中對(duì)LC—MS篩選體系進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，并對(duì)篩選模型的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，該方法線性、重復(fù)性良好。Z'因子評(píng)價(jià)表明該方法可用于高通量篩選。 (三

5、)應(yīng)用已建立的模型對(duì)20個(gè)聯(lián)苯類(lèi)化合物進(jìn)行了初步構(gòu)效關(guān)系研究，并發(fā)現(xiàn)化合物V8804活性高于V8807。利用UHP氧化法合成了內(nèi)標(biāo)物Pep8(O2)-P，在存在內(nèi)標(biāo)及無(wú)內(nèi)標(biāo)的條件下，應(yīng)用質(zhì)譜法測(cè)定其IC50值分別為19.1μM及14.4 μM。同時(shí)應(yīng)用Kinase—Glo()發(fā)光檢測(cè)法測(cè)得其IC50值為15.4μM，證明兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致。 (四)應(yīng)用已建立的模型，篩選了本課題組現(xiàn)有的1，2，7.三取代—1H—咪唑并[

6、4，5—g]喹喔啉—6—酮類(lèi)混合物化學(xué)庫(kù)(1850個(gè)化合物)。發(fā)現(xiàn)了4個(gè)對(duì)RX218有抑制作用的化合物，其IC50值分別為38.3μM(F3—E)，98μM(E5—A)，110μM(D6—D)，72μM(D6—E)。全文總共發(fā)現(xiàn)了13個(gè)活性化合物，其中活性較高的4個(gè)化合物為P3—A7，V8807，V8804，F(xiàn)3—E。 綜上所述，本論文創(chuàng)新點(diǎn)如下： 1.建立了LC—MS激酶抑制劑篩選新方法。該法特點(diǎn)是：均質(zhì)顯著減少了假性

7、結(jié)果、不需要標(biāo)記底物節(jié)約了篩選成本、無(wú)同位素標(biāo)記免除了放射性對(duì)實(shí)驗(yàn)者以及放射性同位素垃圾對(duì)環(huán)境的危害、不需要偶聯(lián)反應(yīng)可以直接對(duì)抑制作用進(jìn)行定量。 2.將組合化學(xué)混合物合成化學(xué)與LC—MS高通量篩選相結(jié)合進(jìn)行混合物化學(xué)庫(kù)篩選，顯著提高了篩選效率。 3.應(yīng)用HPLC—MS聯(lián)用技術(shù)及質(zhì)譜的閥切換功能進(jìn)行樣品的脫鹽處理。 4.LC—MS激酶抑制劑篩選新方法與傳統(tǒng)Kinase—Glo()發(fā)光檢測(cè)法結(jié)果一致。 5.篩