小鼠胎肝間充質(zhì)細(xì)胞和Sca-1~+細(xì)胞體內(nèi)外向肌樣細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、　　目的：探討小鼠胎肝間充質(zhì)和Sca-1~+細(xì)胞在體內(nèi)外向肌樣細(xì)胞分化的潛能。
　　方法：體外無菌條件下獲取胎齡14.5d的小鼠胎肝,制成單細(xì)胞懸液,貼壁培養(yǎng)并傳代,第三代傳代細(xì)胞用10μmol/15-氮胞苷與1mg/1二性霉素B誘導(dǎo)24h,誘導(dǎo)處理后置于完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),不同時間點(diǎn)用半定量RT-PCR法檢測骨骼肌細(xì)胞相關(guān)基因Myf5,Myogenin的mRNA表達(dá)情況,培養(yǎng)后7d和14d,用免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定骨骼肌細(xì)胞特異性抗

2、原Desmin、α-Actin的表達(dá)情況。體內(nèi)實驗按8μg/g體重將Cardiotoxin局部注射入左側(cè)股四頭肌,造成雌鼠骨骼肌損傷模型,24h后將純化的雄性胎肝間充質(zhì)細(xì)胞按1×10~6/只小鼠注射至股四頭肌,無菌環(huán)境下飼養(yǎng)2月后,處死小鼠,制備受體小鼠骨骼肌組織切片,用免疫組織化學(xué)染色對骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記,再進(jìn)一步用熒光標(biāo)記的Y染色體探針進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)檢測雌性受體小鼠骨骼肌組織內(nèi)供體小鼠胎肝間充質(zhì)細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞分

3、化情況。
　　性別鑒定為雄性的胎肝單細(xì)胞懸液經(jīng)MASC分離得到Sca-1~+細(xì)胞,2×10~3個Sca-1~+細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植進(jìn)10Gy照射的同系雌鼠體內(nèi),2月后處死小鼠,制備受體小鼠骨骼肌、心肌組織切片,用免疫組織化學(xué)染色分別對骨骼肌細(xì)胞、心肌進(jìn)行特異性標(biāo)記,再進(jìn)一步用熒光標(biāo)記的Y染色體探針進(jìn)行熒光原位雜交(FISH),檢測雌性受體小鼠骨骼肌組織、心肌組織內(nèi)供體小鼠胎肝Sca-1~+細(xì)胞分別向骨骼肌和心肌細(xì)胞的分化情況。

4、　　結(jié)果：第三代胎肝間充質(zhì)細(xì)胞經(jīng)5-氮胞苷與二性霉素B誘導(dǎo)處理后,細(xì)胞形態(tài)改變出現(xiàn)骨骼肌樣細(xì)胞。半定量RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的骨骼肌細(xì)胞相關(guān)基因Myf5,Myogenin的mRNA隨時間序貫表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞有骨骼肌特異性蛋白如Desmin、α-Actin的表達(dá),且隨培養(yǎng)時間的延長陽性率升高,未誘導(dǎo)組的細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化,骨骼肌特異性蛋白表達(dá)陰性。胎肝間充質(zhì)細(xì)胞體內(nèi)局部注射后2月,在骨骼肌組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在Y