Egr-1特異脫氧核酶對大鼠血管平滑肌細胞纖維連接蛋白表達的影響.pdf

1、目的: 通過對大鼠血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)轉染早期生長反應因子-1(earlygrowthresponsefactor-1，Egr-1)和Egr-1特異脫氧核酶(DNAenzyme/10-23DRZ，ED5)，檢測轉染前后VSMC中Egr-1和纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)表達的變化，研究ED5對大鼠VSMCFN表達的影響。 實驗方法: 1、培養(yǎng)大

2、鼠A10主動脈VSMC用含10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25％胰酶消化、傳代。 2、分組: 分為三組：空白組、Egr-1轉染組、Egr-1+ED5轉染組。各組細胞均用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；Egr-1轉染組穩(wěn)定轉染Egr-1；Egr-1+ED5轉染組對Egr-1穩(wěn)定轉染細胞株瞬時轉染ED5。 3、穩(wěn)定轉染Egr-

3、1當VSMC在6孔板內達到60％融合時進行轉染。具體操作按FuGENE6說明書建議的操作步驟進行。細胞轉染24h后，將細胞轉入直徑10cm的培養(yǎng)板中并加入含400μg/mlG418的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。2周以后，將穩(wěn)定轉染的克隆挑入96孔板中并擴增。 4、ED5的合成設計合成針對Egr-1基因起始密碼AUG的ED5，D5堿基序列為：5’-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGACGT-3’，兩側下劃線所示部分為寡

4、核苷酸識別序列，中間為保守的催化活性區(qū)，在其3’端和5’端各有兩個磷酸二酯鍵進行硫代硫酸修飾，以增加其穩(wěn)定性。 5、ED5的轉染當培養(yǎng)的穩(wěn)定高表達Egr-1的VSMC生長至70％匯合時，更換無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)30h，給予0.1μMED5，進行第一次基因轉染，18h后更換含10％FBS無抗生素的DMEM進行二次轉染。 6、實驗檢測方法用RT-PCR檢測培養(yǎng)的VSMC中Egr-1和FNmRNA表達的變化，用免疫

5、細胞化學法檢測Egr-1和FN蛋白表達的變化。 實驗結果: RT-PCR法檢測到：空白組VSMC中的Egr-1和FNmRNA弱表達，Egr-1轉染組Egr-1和FNmRNA的表達明顯增高(p＜0.01)，Egr-1+ED5轉染組與Egr-1轉染組相比Egr-1和FNmRNA的表達明顯降低(p<0.01)，與空白組相比沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。 免疫細胞化學法檢測到：空白組VSMC中的Egr-1和FN蛋白弱表