Egr-1特異脫氧核酶下調(diào)cyclin D1、TGF-β1和MMPs抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移.pdf

1、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前廣泛應(yīng)用的治療冠心病手段之一，但PCI術(shù)后半年內(nèi)血管重建部位再狹窄(restenosis，RS)影響了它的遠(yuǎn)期療效。RS的機制很復(fù)雜，包括早期的血管彈性回縮和后期的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增生、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生以及血管重塑等。尋找抑制PCI術(shù)后RS的方法仍是當(dāng)前研究的

2、熱點。脫氧核酶(deoxyribozyme，DRz)是一種具有酶催化活性的DNA分子，作為一種基因抑制劑有著實際的治療作用。早期生長反應(yīng)因子-1(early growth responsefactor-1，Egr-1)是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在動脈損傷等外界刺激下被激活，誘導(dǎo)VSMC的分裂、增殖和內(nèi)膜增生。本研究應(yīng)用合成的Egr-1特異脫氧核酶(DNAenzyme/10-23DRz，ED5)及雜碼ED5(scrambled ED5，ED

3、5SCR)，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞中，觀察其對大鼠VSMC增殖、凋亡和遷移的影響，探討其抑制VSMC增殖和遷移的作用機制。
　　 實驗方法：
　　 1、寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)ED5、ED5SCR的合成
　　 ED5、ED5SCR由大連寶生物工程有限公司合成。ED5堿基序列為：5'-CCGCTGCCAGGCTAGCTACAACGACCCGGACGT-3'，E

4、D5SCR堿基序列為：5'-GCCAGCCGCGGCTAGCTACAACGATGGCTCCAC-3'，兩側(cè)下劃線所示部分為寡核苷酸識別序列，中間為保守的催化活性區(qū)，在3'和5'端各有兩個磷酸二酯鍵進(jìn)行硫代磷酸修飾，以增加其穩(wěn)定性。部分5'端用FITC標(biāo)記，以便于在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后基因的分布。
　　 2、大鼠VSMC培養(yǎng)及實驗分組
　　 采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)：體重120～150g Wistar大鼠(中國醫(yī)科大學(xué)實

5、驗動物中心提供)，無菌條件下取出胸主動脈，中膜切塊貼壁，滴加含20％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素pH7.4的Dulbecco'smodified Eagle medium(DMEM)，置于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。0.25％胰酶消化傳代，傳代以后使用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素pH7.4的DMEM維持細(xì)胞生長。經(jīng)形態(tài)學(xué)

6、觀察和采用α-平滑肌肌動蛋白(α—SM-agtin)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為VSMC。選取3～8代細(xì)胞進(jìn)行實驗。
　　 實驗分組為：對照組、ED5組、ED5SCR組。實驗時各組細(xì)胞均使用含10％FBS的不含抗生素DMEM培養(yǎng)；ED5組轉(zhuǎn)染0.1μmol/L ED5 ED5SCR組轉(zhuǎn)染0.1μmol/LED5SCR。
　　 3、VSMC ODN的轉(zhuǎn)染
　　 VSMC使用含10％FBS不含抗生素的DMEM培養(yǎng)，生長至7

7、0％后更換無血清無抗生素DMEM培養(yǎng)30h，進(jìn)行第一次基因轉(zhuǎn)染，18h后更換含10％FBS無抗生素的DMEM進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染。FuGENE6/ODN轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：在1.5ml無菌Eppendorf管中加入無血清無抗生素DMEM，再取適量的FuGENE6加入Eppendorf管中混勻并孵育5min，按FuGENE6與ODN3：1(體積與質(zhì)量之比)的比例分別加入ED5、ED5SCR并混勻，室溫孵育15min。以0.1μmol/L濃度將轉(zhuǎn)染復(fù)合

8、物逐滴加入相應(yīng)分組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染結(jié)果用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測。
　　 4、實驗檢測方法
　　 噻唑藍(lán)[3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]比色法和5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoyuridine，BrdU)摻入法測定ODN轉(zhuǎn)染對VSMC增殖的影響；FCM分析ODN轉(zhuǎn)染對VSMC細(xì)胞

9、周期分布的影響；用FCM和熒光顯微鏡檢測ODN轉(zhuǎn)染對VSMC凋亡的影響；用改良的Boyden小室法(Transwell)、劃痕損傷模型測定ODN轉(zhuǎn)染對VSMC遷移的影響；用RT-PCR檢測Egr-1、PCNA、TGF-β1、p53、p21、Bax、MMP-14、MMP-2、TIMP-2mRNA表達(dá)的變化，用Westernblot檢測細(xì)胞Egr-1、PCNA、TGF-β1、p53、p21、MMP-14、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)水平

10、，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Egr-1、cyclin D1蛋白表達(dá)。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、組織塊貼壁法培養(yǎng)5～6天后可見細(xì)胞從組織塊邊緣處長出，3周后長成單層，呈典型“峰-谷”樣生長。VSMC特異性標(biāo)志蛋白α-SM-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性。貼壁法培養(yǎng)可獲得高純度的VSMC，可傳代培養(yǎng)至24代，10代以后細(xì)胞的增殖能力逐漸降低。
　　 2、倒置熒光顯微鏡檢測ED5、ED5SCR轉(zhuǎn)染VSMC陽性率分別為70.

11、6±1.52％、72±2.73％，可以看到大多數(shù)為細(xì)胞漿染色，少數(shù)為細(xì)胞核染色，其機理為細(xì)胞內(nèi)吞作用。流式細(xì)胞儀檢測ED5、ED5SCR轉(zhuǎn)染VSMC的攝取率分別為13.5％、15.2％。
　　 3、ED5組VSMC的MTT吸光度值較ED5SCR、對照組顯著降低，轉(zhuǎn)染后24、48、72h，ED5對VSMC增殖抑制率分別為25％、20％、18％，ED5SCR組與對照組比較無差別。ED5可明顯抑制10％FBS誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的大鼠胸主動

12、脈平滑肌細(xì)胞增殖。
　　 4、BrdU摻入實驗顯示：對照組、ED5組與ED5SCR組BrdU標(biāo)記率分別為30.46±4.38％、15.37±2.32％、29.17±4.15％。與其它兩組相比，ED5組BrdU標(biāo)記率明顯減少，差異具有顯著性(P<0.01)；ED5SCR與對照組比較無差別。說明ED5轉(zhuǎn)染顯著抑制S期DNA的合成，抑制VSMC增殖。
　　 5、細(xì)胞周期分析顯示，ED5組G0/G1期細(xì)胞百分比高于對照組、ED5

13、SCR組，而S期比例低于對照組、ED5SCR組，細(xì)胞增殖指數(shù)降低，表明ED5可阻止細(xì)胞周期由G0/G1期向S期推進(jìn)，使細(xì)胞停留在G0/G1期，從而抑制VSMC增殖。
　　 6、FCM AnnexinV/FITC、PI雙染及Hoechst33342/PI熒光雙染測定ED5、ED5SCR對VSMC凋亡無影響。
　　 7、劃痕損傷模型測定轉(zhuǎn)染72h后，對照組、ED5組與ED5SCR組VSMC遷移距離分別為159.62±9.57

14、、65.35±5.04、162.84±8.43μm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同其它兩組相比，ED5明顯抑制VSMC遷移(P<0.01)，而ED5SCR對VSMC遷移無影響。
　　 8、改良的Boyden小室法測定ED5轉(zhuǎn)染后6h，VSMC遷移抑制率為32.18％(P<0.01)。ED5SCR對VSMC遷移無影響。
　　 9、RT-PCR檢測到：與ED5SCR、對照組相比，ED5轉(zhuǎn)染抑制VSMC Egr-1、PCNA、TGF-β1、MMP

15、-14、MMP-2mRNA表達(dá)，對p53、p21、Bax、TIMP一2mRNA表達(dá)無影響。
　　 10、Western blot檢測到：與ED5SCR、對照組相比，ED5轉(zhuǎn)染抑制VSMC Egr-1、PCNA、TGF-β1、MMP-14、MMP-2蛋白表達(dá)，對p53、p21、TIMP-2蛋白表達(dá)無影響。未檢測到Bax蛋白表達(dá)。
　　 11、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到ED5轉(zhuǎn)染抑制VSMC Egr-1、cyclin D1蛋白表達(dá)，

16、ED5SCR對VSMC Egr-1、cyclin D1蛋白表達(dá)無影響。
　　 結(jié)論：
　　 1、ED5可特異地抑制Egr-1及其相關(guān)基因的表達(dá)，抑制10％FBS誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞增殖，此作用與其阻止細(xì)胞周期由G0/G1期向S期推進(jìn)，抑制S期細(xì)胞合成，抑制cyclin D1、TGF-β1表達(dá)有關(guān)。ED5SCR無上述作用。
　　 2、ED5可特異地抑制Egr-1，抑制MMP-14表達(dá)，減少MMP-