麗蠅抗病毒肽Alloferon1基因串聯(lián)體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、目的：利用同尾酶構(gòu)建基因同向串聯(lián)體的方法，構(gòu)建Alloferonl基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，并將其在大腸桿菌中融合表達(dá)。為大規(guī)模制備Alloferonl奠定基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)瑞士微生物肽數(shù)據(jù)庫(kù)(APD)收錄的Alloferonl氨基酸序列，選擇大腸桿菌偏愛(ài)密碼子設(shè)計(jì)并合成該基因序列。利用同尾酶法構(gòu)建同向串聯(lián)體的要求，在目的基因的5’端引入EcoRI酶切后的粘性末端，并在其后引入XbaI的酶切位點(diǎn)；在目的基因的3’端引入SalI酶切后

2、的粘性末端，并在其前引入NheI的酶切位點(diǎn)，同時(shí)在XbaI位點(diǎn)后和NheI位點(diǎn)前引入蛋氨酸(Met)密碼子(ATG)，構(gòu)成溴化氰(CNBr)裂解位點(diǎn)。將合成的Alloferonl基因克隆到載體pUC18上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即可獲得Alloferonl單拷貝工程菌。利用XbaI(T▽CTAGA)與NheI(G▽CTAGC)互為同尾酶的特性，二酶切割后的粘性末端均為CTAG，可以進(jìn)行連接，但連接后的新序列TCTAGC不被二酶再識(shí)別，采

3、用ScaI(pUC18上位于多克隆酶切位點(diǎn)外的一個(gè)酶切位點(diǎn))/XbaI和ScaI/NheI分別雙酶切單拷貝重組質(zhì)粒，回收大片段pUC18-Alloferonl和小片段Alloferonl，進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5a，用EcoRI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒即可得到Alloferonl 2拷貝串聯(lián)體。將其與pGEX-4T-1表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，即可獲得Alloferonl 2拷貝串聯(lián)體工程菌。對(duì)IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、IPTG誘導(dǎo)溫度和

4、IPTG誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行摸索，最終確定了最佳表達(dá)條件：當(dāng)菌液A600nm≈0.8時(shí)加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察融合蛋白得到了可溶性的高效表達(dá)。用GSTrapFF 1ml預(yù)裝柱手工進(jìn)行GST融合蛋白的純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳觀察得到了Alloferonl 2拷貝融合蛋白(31KD)。 結(jié)果： 1、按照設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行操作，獲得了Alloferonl基因2串聯(lián)體，經(jīng)E

5、coRI和SalI雙酶切pGEX-4T-1-(Alloferonl)2重組質(zhì)粒之后，在約110bp處可見(jiàn)一條清晰的DNA條帶，其大小與理論計(jì)算值相符。 2、重組的pGEX-4T-1-(Alloferonl)2質(zhì)粒DNA經(jīng)雙脫氧末端終止法測(cè)序，結(jié)果證明，本研究構(gòu)建的Alloferonl基因2串聯(lián)體的核苷酸序列和閱讀框完全正確。 3、含重組pGEX-4T-1-(Alloferonl)2的菌液經(jīng)終濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)

6、表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，在細(xì)菌裂解上清中出現(xiàn)了一條Mr約為31×103的新生GST融合蛋白帶，其分子質(zhì)量大小與理論計(jì)算值相符。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了Alloferonl基因2串聯(lián)體重組質(zhì)粒，獲得了可成功表達(dá)相應(yīng)目標(biāo)融合蛋白的2拷貝串聯(lián)體工程菌。對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了具有較高純度的Alloferonl 2拷貝融合蛋白(31KD)，為進(jìn)一步純化得到Alloferonl單體及其抗病毒活性測(cè)定奠