兩種Flavonoids對氧化應(yīng)激條件下阻力血管的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:(1)研究超氧陰離子(Superoxide anion,O<,2><'->)對大鼠腸系膜阻力血管內(nèi)皮細(xì)胞超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor,EDHF)和一氧化氮(nitricoxide,NO)引起的血管舒張功能的影響及其可能機(jī)制;(2)探討杭白菊總黃酮及其有效成分木犀草素和芹菜素的阻力血管舒張功能保護(hù)作用并研究相關(guān)機(jī)制. 方法: (1)阻力血管張力測定:

2、雄性Sprague-Dawley大鼠,體視顯微鏡下取腸系膜血管三級分支約2mm長血管環(huán),置于DMT 610 M系統(tǒng)中3T℃生理鹽溶液(PSS)恒溫灌流,持續(xù)通以95﹪O<,2>和5﹪CO<,2>的混合氣,并通過PowerLab生物信號采集系統(tǒng)記錄張力變化.血管環(huán)浴液中加入焦酚(O<,2><'->的供體)建立O<,2><'->損傷模型,檢測在阻力血管中O<,2><'->對其內(nèi)皮依賴性和非依賴性舒張反應(yīng)的影響; (2)腸系膜血管床灌

3、注壓測定:迅速取出腸系膜血管床并置于PSS液中,在靠近盲腸端結(jié)扎,在十二指腸處分離腸系膜動(dòng)、靜脈,靜脈處結(jié)扎并在動(dòng)脈處插管,同時(shí)將血管床從腸管分離;37℃并持續(xù)通以95﹪O<,2>和5﹪CO<,2>混合氣的PSS液用蠕動(dòng)泵以5 mL/min的速度恒溫灌流血管床;血管反應(yīng)以灌注壓改變計(jì)量;60 min穩(wěn)定后,將灌流系統(tǒng)形成一個(gè)循環(huán)的系統(tǒng),總?cè)莘e為50 mL;以1μM苯腎上腺素(PE)灌流血管床,形成的灌注壓一般在120-130 mmHg,

4、待穩(wěn)定后加入1μM乙酰膽堿(ACh)檢驗(yàn)血管床內(nèi)皮完整性; (3)阻力血管平滑肌細(xì)胞膜電位測定:待血管穩(wěn)定后,膜電位應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)微電極的方法記錄.玻璃微電極內(nèi)充3M KCI溶液,電極電阻50-80兆歐,參考電極為銀絲制作的Ag-AgCI電極.膜電位引出后經(jīng)微電極放大器同步顯示記錄.借助于解剖顯微鏡,用微電極推進(jìn)器將電極由血管外膜面插入,在細(xì)胞內(nèi)至少穩(wěn)定15s后開始觀察.判斷電極插入細(xì)胞的指標(biāo)是:①記錄曲線由零電位驟然下降超過一40

5、mV,且穩(wěn)定于此水平;②電極由細(xì)胞內(nèi)提出后,記錄曲線迅速恢復(fù)到插入前的水平; (4)血管切片超氧陰離子含量測定:用冰凍切片機(jī)將血管切成約30 μm厚的血管薄片,并用超氧陰離子熒光標(biāo)記物DHE標(biāo)記,利用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度變化;胞質(zhì)中DHE可呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,被過氧化物氧化后進(jìn)入細(xì)胞DNA呈現(xiàn)紅色熒光(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長610 nm).血管薄片在37℃ PSS緩沖液中穩(wěn)定30 min,然后加入含有DHE(2 μM)的緩沖

6、液,蓋上蓋玻片在37℃的暗室中孵育30 min,然后放置于熒光顯微鏡上觀察熒光強(qiáng)度變化. 結(jié)果:焦酚(10,100,300和1000 μM)可濃度依賴性地引起ACh誘導(dǎo)的腸系膜阻力血管舒張功能減弱;其中,300μM焦酚顯著減弱腸系膜血管環(huán)由ACh誘導(dǎo)的EDHF和NO介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張效應(yīng),但對硝普鈉和吡那地爾引起的內(nèi)皮非依賴性的血管舒張作用無明顯影響;同時(shí)300μM焦酚顯著減弱了ACh誘導(dǎo)的超極化.給予杭白菊總黃酮灌胃可以

7、減弱焦酚對血管床灌注壓的降低;木犀草素和芹菜素明顯減弱焦酚對腸系膜阻力血管舒張和超極化的損傷;血管環(huán)超氧陰離子含量測定進(jìn)一步證明木犀草素和芹菜素可以降低血管環(huán)氧化應(yīng)激狀態(tài)下的超氧陰離子含量. 結(jié)論:O<,2><'->濃度依賴性地引起ACh誘導(dǎo)的大鼠腸系膜阻力血管內(nèi)皮依賴性舒張效應(yīng)和超極化減弱,提示O<,2><'->可抑制阻力血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng);其機(jī)制可能是O<,2><'->抑制了阻力血管內(nèi)皮細(xì)胞EDHF和NO的作用,繼而抑制