轉(zhuǎn)染Brn2、Ascl1、Myt1l基因的BMSC在體外分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的初步研究.pdf

1、[目的]:
　　 腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，其致殘率和病死率均很高。腦卒中治療的關(guān)鍵是重建神經(jīng)通路，重建神經(jīng)通路的前提是有新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生。成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，給腦卒中的治療帶來(lái)了新的曙光。但神經(jīng)干細(xì)胞的組織來(lái)源一直是這一研究領(lǐng)域最棘手的問(wèn)題。
　　 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stroma1 cell，BMSC)，是存在于骨髓基質(zhì)中一種成體干細(xì)胞，來(lái)源于中胚層，具有很強(qiáng)的自我增殖和多

2、向分化能力，可以分化為多種不同的組織細(xì)胞，是組織工程學(xué)研究中的一種理想種子細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外可被誘導(dǎo)分化神經(jīng)細(xì)胞，如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可以被化學(xué)物質(zhì)如視黃酸、β-巰基乙醇，中藥如黃芩甙、天麻等誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞。但是利用轉(zhuǎn)錄因子Brn2、Asc11、Myt11基因?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究在國(guó)內(nèi)尚屬空白。
　　 Brn2又稱為POU3F2，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中表達(dá)。有研究表

3、明，Brn2可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達(dá)，在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Asc11基因的編碼產(chǎn)物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(BHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族之一。Asc11在神經(jīng)定型、分化，以及嗅覺(jué)與自主神經(jīng)元的發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Myt11基因又稱為Nzf1基因，可特異性結(jié)合于視黃酸反應(yīng)原件，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活化作用。Myt11基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)與腦垂體的基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。
　　 因此，本研究擬通過(guò)克隆并構(gòu)建一個(gè)含有Brn2、Asc1

4、1、Myt11基因的慢病毒表達(dá)載體，初步探討轉(zhuǎn)染Brn2、Asc11、Myt11基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞的情況，為下一步進(jìn)行骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)移植或基因治療打下基礎(chǔ)。
　　 [方法]:
　　 1.用Percol1淋巴細(xì)胞分離液分離出大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，并用含20％(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，胰酶消化傳代，擴(kuò)增大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。
　　 2.采用PCR技術(shù)克隆出長(zhǎng)分別為696bp、1

5、338bp及3558bp的Brn2、Asc11、Myt11基因部分序列，利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pLV.EX3d.nu1l-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11質(zhì)粒。經(jīng)酶切、PCR、DNA序列分析鑒定確定載體構(gòu)建無(wú)誤。
　　 3.取第四代、第六代BMSC，用慢病毒轉(zhuǎn)染法介導(dǎo)Brn2、Asc11、Myt11基因進(jìn)入到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)。觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 [結(jié)果1:
　　 1.

6、大鼠BMSC的分離培養(yǎng)用Perco11淋巴細(xì)胞分離液對(duì)大鼠骨髓作密度梯度離心，所得細(xì)胞為比較均一的球形單個(gè)核細(xì)胞，臺(tái)盼蘭染色細(xì)胞活力達(dá)99％。接種培養(yǎng)10-14天后，細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底，進(jìn)行細(xì)胞的首次傳代。傳3-4代后，可以形成較典型的BMSC，細(xì)胞大而扁，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立體感不強(qiáng)。
　　 2.Brn2、Asc11、Myt11基因片段經(jīng)測(cè)序鑒定，克隆基因序列與GenBank收錄小鼠Brn2(NC_000070

7、.5)、Asc11(NC_000076.5)、Myt11(NC_000078.5)完全同源。并以此成功構(gòu)建Brn2、Asc11、Myt11基因的真核表達(dá)載體pLV.EX3d.nu11-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11。
　　 3.BMSC轉(zhuǎn)染帶有Brn2、Asc11、Myt11基因的表達(dá)載體后，可以觀察到胞體收縮，折光性增強(qiáng)，并伸出較長(zhǎng)軸突和樹突樣突起，形態(tài)類似神經(jīng)細(xì)胞。
　　 [結(jié)論]:轉(zhuǎn)