探討冠狀動脈擴張發(fā)生的相關機制及生長分化因子-15的內(nèi)皮保護作用.pdf

1、研究目的
　　 1.通過回顧性研究，分析在我院行冠狀動脈造影檢查并診斷現(xiàn)CAE的患者的臨床、冠脈造影結果及其臨床意義。
　　 2.通過測定與分析多種細胞分泌因子，包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮素-1（endothelin，ET-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1（Tissue inhabitor of Metalloproteinase-1，TIMP-1）和生長分化

2、因子-15（GDF-15）等的水平來初步探討這些因素在冠狀動脈損傷如擴張和狹窄的不同病程中參與的不同機制及可能發(fā)揮的關鍵作用。
　　 3.在基因水平上，對ACE Intron16 I/O，AT1R1166 A/C，MMP-91562 C/T及GDF-15-3148C/G五個基因位點進行多態(tài)性研究，希望得到CAE和OCAD（Obstructivecoronary artery disease）的相關基因，從遺傳上探討兩種不同冠脈損

3、傷的差異。
　　 4.通過對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）分別加入不同濃度的葡萄糖、胰島素、HDL、LDL、oxLDL、Angll刺激不同時間，并應用熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應（real time RT-PCR）方法探索對GDF-15轉錄及表達水平的影響，從而在體外研究水平上，探討GDF-15在內(nèi)皮細胞受到動脈粥樣硬化相關危險因素損傷過程中的

4、可能變化。
　　 5.利用GDF-15體外刺激HUVEC細胞，通過測定內(nèi)皮細胞的一氧化氮（NO）濃度以及一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），內(nèi)皮素（ET-1），細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）和血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）的表達水平，進

5、一步研究不同濃度不同時間GDF-15刺激對內(nèi)皮功能的影響，揭示GDF-15對血管內(nèi)皮細胞從代償?shù)綋p傷過程中的變化規(guī)律。
　　 研究方法
　　 1.收集于2005年1月支至2009年12月在我院心內(nèi)科行冠脈造影檢查并診斷為CAE的患者共48例，回顧性研究分析這些CAE患者臨床特點和冠脈造影結果，并對其進行電話及門診隨訪，記錄臨床終點事件。
　　 2.收集CAE患者、冠心病（狹窄阻塞性病變）患者（obstructiv

6、e coronary arterydiseases，OCAD）及正常對照組（Normal coronary artery，NCA）記錄其臨床資料并收集血漿，采用ELISA方法測定所有研究對象的外周血NO，ET-1，MMP-9，TIMP-1和GDF-15的濃度。根據(jù)冠脈損傷的不同特點，將CAE組分為兩組：單純冠脈擴張組（Isolated coronary artery ectasia，ICAE）和冠脈擴張合并狹窄阻塞性病變（coronar

7、y with both Ectasia and Stenosis，CAE+Stenosis）組，進一步進行各組間多種細胞分泌因子的濃度差異的比較研究。
　　 3.在基因水平，采用限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性，片段長度多態(tài)性及直接測序等技術對所有研究對象的基因型ACE Intron16 I/D、AT1R1166 A/C、MMP-91562C/T及GDF-15-314SC/G進行多態(tài)性分析。
　　 4.采用體外分離培養(yǎng)HUVE

8、C的方法，以HDL、LDL、oxLDL、Angll和信號通路阻斷劑SP600125、U0126、SB203580，以及葡萄糖、胰島素單獨或聯(lián)合刺激，設計不同的刺激濃度梯度和刺激時間，并通過Real-Time PCR檢測分析GDF-15轉錄水平的變化。
　　 5.GDF-15體外刺激HUVEC細胞，按GDF-15作用時間分為2組（36h和72h），每組5個濃度（0、400、600、800、1000、1500pg/mL），利用試劑盒

9、檢測內(nèi)皮細胞上清的一氧化氮濃度，并利用Real-Time PCR分析一氧化氮合酶、內(nèi)皮素、細胞間粘附分子-1和血管細胞粘附分子-1的表達水平變化。
　　 6.用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的，以中位數(shù)（25百分位-75百分位）表示，采用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)（百分比）表示，采用PearsonChi-Square檢驗；P<

10、0.05（two-tailed）為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果
　　 1.CAE患者的臨床癥狀及危險因素與因冠心病入院的患者無特殊性。
　　 2.CAE患者以單支病變19例（39.6％）為主，其中單支病變以RCA多見，雙支病變以LAD多見。CAE患者以LAD多見（71％）；RCA其次（67％）。CAE患者往往伴隨著冠脈動脈粥樣硬化損傷，單純CAE28例（58.3％）；冠脈擴張合并狹窄阻塞性病變20例（41.

11、70％）。
　　 3.CAE組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計學差異（p=0.007）。進一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進行統(tǒng)計學分析：ICAE組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計學差異（P=0.022）；CAE+Stenosis組NO水平高于OCAD組，具有統(tǒng)計學差異（P=0.014）。ET-1在各組之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。
　　 4.CAE組MMP-9水平高于NCA組和OCAD組，并

12、且具有統(tǒng)計學差異（P=0.004和P=0.025）。進一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進行統(tǒng)計學分析：ICAE組MMP-9水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計學差異（P=0.007和P=0.027）；CAE+Stenosis組MMP-9水平高于NCA組，并且具有統(tǒng)計學意義（P=0.042）。NCA組TIMP-1水平顯著高于其他各組（P<0.05），但CAE組與OCAD組無顯著差異（P>0.05）。
　

13、　 5.CAE組GDF-15水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計學差異（P=0.045和P=0.037）。進一步將CAE組分為ICAE組和CAE+Stenosis組進行統(tǒng)計學分析：CAE+Stenosis組GDF-15水平高于NCA組和OCAD組，并且具有統(tǒng)計學差異（P=0.008和P=0.014）；CAE+Stenosis組GDF-15水平高于ICAE組，但尚未達到統(tǒng)計學差異。
　　 6.ACE Intron16 I/

14、D，AT1R1166 A/C，MMP-91562 C/T及GDF-15-3148C/G在本研究的各組人群之間未達到統(tǒng)計學差異，提示這些位點可能與CAE發(fā)生過程無相關性。
　　 7.在本研究中MMP-91562 C/T多態(tài)性與血漿中MMP-9表達水平并無顯著相關性。
　　 8.在本研究中GDF-15-3148C/G多態(tài)性與血漿中GDF-15的表達水平無顯著相關性。
　　 9.HUVEC經(jīng)不同濃度LDL刺激12小時，

15、GDF-15的表達水平變化并不一致，但刺激24時均為使其表達量下調(diào)；HUVEC經(jīng)不同濃度HDL刺激12小時，GDF-15的表達水平變化并不一致，時間延長至24小時上調(diào)GDF-15的表達，并且與HDL濃度升高成正比；不同濃度oxLDL刺激12或24小時后，均顯著上調(diào)GDF-15的表達，并呈時間依賴性，24小時后GDF-15的表達有所下降。
　　 10.高糖刺激12小時和24小時可增加GDF-15的表達；不同濃度胰島素作用12小時可

16、增加GDF-15的表達，低濃度組隨時間延長表達量升高；高糖和不同濃度胰島素聯(lián)合作用12及24小時均降低GDF-15的表達，低濃度胰島素組24小時表達量上升。
　　 11.不同濃度Angll刺激6小時、12小時后均上調(diào)HUVEC中GD-15的表達，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，作用24小時后最低和最高濃度的GDF-15表達量降低。加入SB203580后6小時、12小時和24小時GDF-15表達顯著升高。加入SP6001.25后6小時GDF

17、-15顯著升高，12小時后顯著降低，24小時后變化不顯著。加入U0126后6小時GDF-15表達量升高，但12小時和24小時后GDF-15降低。
　　 結論
　　 1.CAE患者與OCAD患者臨床癥狀相似，以單支病變?yōu)橹?，其中單支病變以RCA為主，CAE患者往往伴隨著冠脈動脈粥樣硬化損傷。
　　 2.冠脈擴張可能是冠脈為了抵抗動脈粥樣硬化而早期啟動的機體正常的防御機制。單純冠脈擴張可能是冠脈粥樣硬化損傷前期內(nèi)皮保

18、護功能亢進階段。
　　 3.CAE與OCAD在MMP-91562 C/T和GDF-15-3148C/G基因多態(tài)性上無統(tǒng)計學差異并且與血漿MMP-9和GDF-15水平無相關性。
　　 4.多種危險因素相關因子和物質(zhì)均可對HUVEC內(nèi)GDF-15的轉錄活性產(chǎn)生一定的影響，結合GDF-15的抗炎癥反應、促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞過度增殖的保護作用，說明GDF-15可以由內(nèi)皮細胞分泌并發(fā)揮一定的功能。
　　 5.體外實驗