骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對MHC半相合HSCT移植物抗腫瘤作用影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cells transplanta．tion，allo-HSCT)的卓越治療效果與移植物抗腫瘤(graft versus tumour，GVT)效應(yīng)有關(guān)。預(yù)防移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的措施如T細(xì)胞去除(TCD)和免疫抑制劑的應(yīng)用，同時(shí)也會減弱GVT效應(yīng)和有效植活。目前認(rèn)為GVHD與GVT均為免疫反

2、應(yīng)，T細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞，二者相互聯(lián)系，但在一定程度上可以分離。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)是骨髓中一類具有高度自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，由于有較低的免疫原性，對異基因活化的淋巴細(xì)胞具有增殖抑制作用，在異基因器官和細(xì)胞移植有廣泛應(yīng)用前景。MSC在異基因造血干細(xì)胞移植中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究已表明BMMSC能抑制aGVHD的發(fā)生，但對惡性血液病移植中GVT的影響尚無定論。 本研究利用MHC半相合造血干細(xì)胞移植荷

3、瘤動物模型，進(jìn)一步探討MSCs誘導(dǎo)免疫耐受的同時(shí)對移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)的影響。 方法： 1 動物及細(xì)胞株1．1 動物移植供鼠為清潔級C57BL/6<'H-2b>(B6)，8～12周齡；受鼠為清潔級CB6F1(BALB/c<'H-2d>×C57BL/6F1，CB6F1<'H-2d×b>)，8～12周齡；MSC供鼠為清潔級B6，4～6周齡；以上動物雌雄兼用，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 1.2 B16細(xì)胞株小鼠黑色素瘤細(xì)

4、胞株(B16)購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部，接種于CB6F1小鼠成瘤率達(dá)100％。10％FBS H-DMEM完全培養(yǎng)液，37℃、5％CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)使用對數(shù)生長期細(xì)胞。 2 MSC的制備將供B6小鼠脫頸椎處死后，常規(guī)無菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，10％FBS F12/DMEM完全培養(yǎng)基沖出骨髓，輕輕吹打后以10<'7>/ml的密度種植于培養(yǎng)瓶中，72小時(shí)后行首次換液，此后每3-4天換液一次，當(dāng)貼壁細(xì)胞層達(dá)到90％以上融

5、合時(shí)，以0.25％胰酶加0.02％EDTA消化，行1：2傳代，傳至第3代以后的細(xì)胞，調(diào)整濃度待用。 3 荷瘤動物模型的建立將B16細(xì)胞接種于CB6F1小鼠左前腋下，待腫瘤長至約1×1×1cm<'3>的時(shí)候無菌條件下取出腫瘤塊，去掉中間的壞死組織后剪碎并研磨，PBS重懸后制得單個(gè)核細(xì)胞，臺盤藍(lán)拒染率>95％，調(diào)整濃度至備用。 4 半相合荷瘤移植模型的建立供受鼠均于移植前3天開始飲用酸化水；以CB6F1為受鼠，將研磨制得的B

6、16細(xì)胞接種于受鼠左前腋下，24小時(shí)后接受<'60>Coγ射線亞致死性全身照射(TBI)9.5Gy，劑量率為0.63Gy/min，預(yù)處理后2小時(shí)內(nèi)尾靜脈注射供鼠細(xì)胞，進(jìn)行骨髓、脾淋巴細(xì)胞混合移植(骨髓MNC2.3×10<'6>+脾MNC7×10<'6>)/鼠，實(shí)驗(yàn)組同時(shí)輸注不同劑量MSCs，并設(shè)立對照組。 5 移植分組a．同基因移植組：CB6F1→TBI+B16+CB6F1； b．無MSC移植組(GVHD組)：B6→TBI+B1

7、6+CB6F1； c．低劑量MSC組：B6→TBI+B16+CB6F1+MSC(5×10<'3>/鼠)； d．中劑量MSC組：B6→TBI+B16+CB6F1+MSC(5×10<'4>/鼠)； e．高劑量MSC組：B6→TBI+B16+CB6F1+MSC(5×10<'5>/鼠)；f.TBI對照組； g．TBI+B16對照組； h．B16成瘤對照組； 6 MSC對免疫細(xì)胞恢復(fù)的影響分別于移植

8、前和移植后第21天時(shí)無菌采集各組存活小鼠眼眶血，分別注入肝素抗凝的無菌試管內(nèi)，每份標(biāo)本另取3只流式管，并于其內(nèi)壁一側(cè)分別加入5μl mCD4，5μlmCD8，及10μlhCD56(Human，Cross-Reactivity*：Mouse)，于流式管內(nèi)壁的另一側(cè)依次加入5μl mCD3，然后加入30μl已抗凝血并混勻，經(jīng)固定離心后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3<'+>CD8<'+>細(xì)胞和CD3<'+>CD4<'+>細(xì)胞和CD3<'->CD56

9、<'+>細(xì)胞含量，計(jì)算CD4<'+>/CD8<'+>比值。 7 觀察內(nèi)容 自移植開始每天觀察動物精神狀態(tài)，GVHD發(fā)生情況、死亡時(shí)間，計(jì)算平均生存時(shí)間，繪制荷瘤組小鼠生存曲線；-1d～+60 d隔日在固定時(shí)間由尾靜脈取血計(jì)數(shù)白細(xì)胞，稱量動物體重，測量小鼠瘤塊的大小并進(jìn)行比較。 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)計(jì)分析采用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行均數(shù)間比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1 動物

10、體重變化：各移植組體重均于+6d～+7d達(dá)到最低，且a、c、d、e組均較b組體重恢復(fù)快。f組體重于+10d～+11d達(dá)到最低后緩慢增長，并獲得長期生存；g組于+19d～+20d達(dá)到最低水平，以后體重增長速度較快，但小鼠消瘦嚴(yán)重。 2 WBC恢復(fù)情況：經(jīng)過照射組動物的外周血白細(xì)胞均于+4d達(dá)最低水平。a、b、c、d、e、f、g組植入時(shí)間分別為9±2.1d、8.4.±1.2d、6.2±1.7d、4.3±1.1d、5.8±2.3d、2

11、0±2.0d、20±1.51d。各MSC移植組造血重建時(shí)間明顯早于自體移植組和無MSC移植組，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。f組和g組造血恢復(fù)最慢，與所有移植組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3 GVHD發(fā)生情況：e組出現(xiàn)aGVHD的時(shí)間明顯晚于b組(27±3.0d＆10±2.3d，P<0.05)，aGVHD發(fā)生率分別為60％(6/10)、100％(17/17)，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；使用MSC各組小鼠aGVHD表現(xiàn)較b組輕微，甚至無明顯aGVHD表現(xiàn)

12、。 4 MSC對移植后腫瘤大小的影響：+30d時(shí)c組小鼠腫瘤為1.22±0.41cm<'3>，h組為20.85±1.40cm<'3>。h組與其它各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；a組和g組與b、c、d、e各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但a組和g組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示同基因移植無抗腫瘤作用；使用MSC的c、d、e組+30d腫瘤大小雖隨著MSC輸注數(shù)值的增高，腫瘤有增大的趨勢，但各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與無MSC的b組比較亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)

13、現(xiàn)aGVHD嚴(yán)重者，其瘤塊較aGVHD輕者小鼠瘤塊小。 5 生存時(shí)間觀察：a、b、c、d、e組小鼠生存時(shí)間分別為58.71±3.29、54.41±7.62、59.63±1.06、59.44±1.67、58±4.0。f、g、h組小鼠生存時(shí)間明顯縮短，與a、b、c、d、e組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。b組小鼠生存時(shí)間與c、d、e組比較無顯著性差異，但b組小鼠+50d天生存率明顯低于c、d、e組。 6 MSC對移植后免

14、疫細(xì)胞恢復(fù)的影響移植+21d時(shí)CD3<'+>細(xì)胞在同基因移植a組中表達(dá)明顯低于半相合移植組。c、d、e組CD3<'+>細(xì)胞伴隨MSC的輸注有降低趨勢，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示MSC可減弱GVHD，并與劑量呈正相關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 b、c、d、e組移植后CD8<'+>細(xì)胞明顯高于移植前，提示半相合移植伴隨明顯GVT效應(yīng)；在MSC組中隨MSC輸注數(shù)量的提高，CD3<'+>CD8<'+>細(xì)胞有不同程度的降低，說明MSC可

15、減弱GVT效應(yīng)。 a組CD4<'+>/CD8<'+>比值較其余各移植組恢復(fù)快，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明同基因移植機(jī)體免疫恢復(fù)迅速；移植后+21d時(shí)b、c、d、e組CD4<'+>/CD8<'+>比值仍較低，說明半相合移植免疫恢復(fù)緩慢。移植后b、c、d、e組CD4<'+>/CD8<'+>比值隨MSC數(shù)量的提高有增高趨勢，但組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MSC可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)。 聯(lián)合MSC移植的c、d、e組中隨MSC輸注數(shù)量的提

16、高，CD3<'+>CD4<'+>細(xì)胞含量有增高的趨勢，但組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組小鼠移植后CD3<'->CD56<'+>細(xì)胞含量，隨MSC輸注數(shù)量的提高有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MSC對NK細(xì)胞影響較小。 結(jié)論： 1 半相合移植組腫瘤明顯小于自體移植組，提示半相合移植組具有GVT效應(yīng)。 2 MSC可以促進(jìn)造血細(xì)胞植入，減輕aGVHD，延長受鼠生存期。 3 輸注MSC可延遲aGVHD的