蛻膜細胞中孕激素受體及TNF-α、IL-1β、NF-κB改變致自然流產的研究.pdf

1、不明原因自然流產的發(fā)生與細胞因子、免疫系統(tǒng)、激素及其受體的調控之間的相互作用越來越受到重視，這一系列的因素與子宮內膜的正常蛻膜化、孕囊的植入和胚胎的正常發(fā)育均有密切的關系。在正常妊娠中，孕激素是維持妊娠的重要激素，孕激素主要通過孕激素受體(PR)起作用，蛻膜組織中要有一定的孕激素受體(PR)量才能對激素產生正常的反應。受體數量減少或功能減退，會影響相應的激素發(fā)揮其生理功能。人們發(fā)現對習慣流產病人單用孕激素或絨毛膜促性腺激素治療并未獲得理

2、想的保胎效果，所以在孕激素補足后仍然發(fā)生流產的原因是國內外研究的熱門課題。
　　 炎癥因子是導致流產的重要因素之一，其引起流產的機制是目前研究的重要方向。已經有報導許多炎性細胞因子參與流產、早產、分娩啟動等生理或病理過程，腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、核轉因子κB(NF-κB)等是目前研究較多的細胞因子。
　　 細菌脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞壁外膜中的重要組成成分，能促進TNF-α、IL

3、-1β、NF-κB在細胞中的表達。近幾年的研究發(fā)現NF-κB在哺乳動物的生殖過程中可能參與著床前胚胎的發(fā)育、著床、蛻膜化、分娩等多個生殖環(huán)節(jié)。白細胞介素-1β(IL-1β)在激活NF-κB轉錄活性的同時會抑制PR的轉錄活性。腫瘤壞死因子-a(TNF-α)則是誘導IL-1β產生的強刺激劑。
　　 我們通過研究自然流產患者的蛻膜細胞中孕激素受體(PR)和腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1β)、核轉錄因子κB(NF-κ

4、B)等的表達情況，與正常妊娠蛻膜細胞中比較存在明顯的差異；再進行體外培養(yǎng)原代蛻膜細胞，研究細菌脂多糖(LPS)作用后的蛻膜細胞中PR的表達情況，進一步證實感染導致孕激素受體減少是引起自然流產的主要原因之一。
　　 本研究分為三部分，第一部分，采用RT-PCR方法研究自然流產和正常妊娠蛻膜細胞中孕激素受體mRNA含量；采用原位雜交免疫組化法研究孕激素受體(PR)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、核轉錄因子

5、κB(NF-κB)等在自然流產和正常妊娠蛻膜細胞中的蛋白表達差異。第二部分，體外培養(yǎng)原代蛻膜細胞，建立無血清細胞模型；在體外培養(yǎng)的蛻膜細胞中加入不同濃度脂多糖(LPS)，模擬妊娠革蘭陰性菌感染，從光鏡下和電子顯微鏡下觀察感染后蛻膜細胞生長抑制率和細胞超微結構的改變。第三部分，取不同濃度脂多糖(LPS)作用的蛻膜細胞，用RT-PCR方法研究PR、TSF-α、IL-1β、NF-κB mRNA表達差異；同時提取蛋白質，用蛋白印跡法研究PR和N

6、F-κB的蛋白質表達差異，進一步證實脂多糖可通過引起炎癥因子的增加而使孕激素受體的表達下調，為不明原因自然流產的治療提供新的思路。
　　 第一部分孕激素受體改變在自然流產中的研究。
　　 目的：
　　 測定孕激素受體mRNA和孕激素受體及細胞因子TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白質在自然流產和正常妊娠蛻膜細胞中的表達差異。
　　 方法：
　　 收集自然流產組病例30例作為研究組，另有正常早孕人

7、工流產組病例30例作為對照組，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RZ-PCR)方法從轉錄水平檢測兩組子宮蛻膜細胞中的PR mRNA含量差異。
　　 應用原位雜交免疫組化方法檢測PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白質在兩組蛻膜細胞中的表達差異，分析PR與TNF-α、IL-1β、NF-κB之間的相互關系，研究PR對妊娠的影響。
　　 結果：
　　 1.研究組蛻膜細胞中PR mRNA含量比對照組明顯減少(P<0.05)

8、。2.研究組蛻膜細胞的PR免疫組化染色陽性標本百分率低于對照組，兩組間百分率比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但兩組間平均染色分值比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；3.研究組蛻膜細胞中 TNF-α、IL-1β和NF-κB免疫組化染色陽性百分率均高于對照組，兩組間比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；4.PR的表達與NF-κB的表達呈負相關性，(r=-0.628，P<0.05)，NF-κB的表達與 TNF-α、IL-1β的表達呈正相關(P<

9、0.05)。
　　 結論：
　　 1.與正常妊娠相比較，自然流產蛻膜細胞中PR mRNA表達減少。
　　 2.與正常妊娠相比較，自然流產蛻膜細胞中PR蛋白表達減少；
　　 3.自然流產蛻膜細胞中TNF-α、IL-1β與NF-κB蛋白表達增加；
　　 4.自然流產蛻膜NF-κB的蛋白表達與PR的蛋白表達呈負相關。
　　 第二部分脂多糖對體外培養(yǎng)蛻膜細胞損傷的研究。
　　 目的：

10、>　　 培養(yǎng)原代人蛻膜細胞，建立體外人蛻膜細胞模型，加入不同濃度的脂多糖(LPS)，模擬妊娠期革蘭陰性細菌感染，研究脂多糖對體外培養(yǎng)蛻膜細胞的損傷。
　　 方法：
　　 獲取正常妊娠6～8周的蛻膜組織，采用復合酶消化法全組分細胞培養(yǎng)，細胞傳代自然增殖法純化蛻膜基質細胞，用免疫細胞化學染色方法和熒光免疫法檢測細胞的垂體泌乳素(PRL)表達，進行細胞特征學鑒定，建立體外人蛻膜細胞模型。在此模型上加入不同濃度的LPS，使終濃

11、度分別為25 ng/ml，50 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，培養(yǎng)24h、48h、72h后，應用MTT法測得感染后蛻膜細胞生長抑制率，48h后光鏡和電子顯微鏡下觀察細胞結構的改變。
　　 結果：
　　 細胞培養(yǎng)成功，原代培養(yǎng)鏡下可見幾種細胞成分，絕大部分為單純蛻膜基質細胞(decidual stromal cell，DSC)，呈梭形或不規(guī)則的星形，核呈卵圓形，大而圓，鏡下形態(tài)一致。PRL免疫細胞化學

12、和熒光免疫法證實90％的培養(yǎng)細胞呈陽性，顯示DSC已經得到較高的純化，且其分泌功能仍保持正常。加入不同濃度的LPS后，采用MTT法測定細胞的抑制率，發(fā)現在24h時段下，研究組與對照組比較，各濃度的LPS對DSC的抑制率無明顯影響，P值大于0.05，無統(tǒng)計學意義；而作用48h、72h以后，細胞的抑制率則有明顯不同，加入高濃度(200 ng/ml)LPS的研究組抑制率為16.88％，明顯高于低濃度(25 ng/ml)LPS的研究組3.96％

13、；在光鏡下，低濃度LPS對蛻膜細胞的影響幾乎看不到，高濃度的LPS作用DSC后有輕微改變，而透射電鏡下觀察到對照組細胞突觸清晰可見，微絨毛不多，核膜核仁完整，染色質分布均勻，研究組可見細胞體積縮小，表面突起增多，胞漿內空泡增多，線粒體水腫等細胞凋亡改變。而且隨著LPS濃度的增加，細胞器損傷更明顯，出現細胞固縮，胞漿水腫或長滿絨毛，核固縮，核膜破裂、裂解。
　　 結論：
　　 1.建立體外人蛻膜細胞模型成功；
　　

14、 2.不同濃度LPS作用于體外培養(yǎng)的蛻膜細胞48小時和72小時，細胞的抑制率明顯增加，且濃度增加細胞的抑制率；
　　 3.不同濃度LPS可以使蛻膜細胞發(fā)生明顯的超微結構改變，且隨LPS的濃度逐漸增加細胞器損傷逐漸加重。
　　 第三部分 LPS致蛻膜細胞中孕激素受體改變的研究。
　　 目的：
　　 研究LPS感染體外培養(yǎng)的蛻膜細胞中孕激素受體和細胞因子核酸和蛋白質的表達差異。
　　 方法：
　

15、　 取第三代蛻膜細胞，加入LPS使終濃度分別0ng/ml(對照組)，25ng/ml(研究1組)，50ng/ml(研究2組)，100ng/ml(研究3組)，200ng/ml(研究4組)，在加藥48h后用逆轉錄-聚合酶鏈法(RT-PCR)測PR、TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA水平表達差異；用蛋白印跡法(Western Blot)從蛋白質水平分析蛻膜細胞受LPS作用后PR、NF-κB表達的差異。
　　 結果：
　

16、　 1.不同濃度LPS作用后，PR的mRNA出現較明顯的遞減趨勢，研究組1、2、3和對照組比較，PR mRNA有減少，但改變不明顯(P>0.05)；研究組4與對照組比較PR mRNA明顯減少(P<0.05)，且與研究組1、2、3組比較也明顯減少(P<0.05)。2.不同濃度LPS作用，TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA均出現較明顯的遞增趨勢，研究組和對照組比較TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA明顯增加(P<0.05

17、)，研究組各組間比較TNF-α、IL-1β、NF-κB的mRNA豐度有增加，但改變不明顯(P>0.05)。3.研究組的蛻膜細胞PR蛋白表達豐度顯著低于對照組(P<0.05)，且隨著LPS的濃度逐漸增加，PR蛋白的表達也逐漸減弱；研究組的蛻膜細胞NF-κB蛋白表達豐度顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著LPS的濃度逐漸增加，NF-κB蛋白的表達也逐漸增加。
　　 結論：
　　 1.不同濃度LPS可以誘導蛻膜細胞PR mR